[发明专利]工程大肠杆菌合成牡荆素和荭草苷的应用

说明书

本发明涉及工程大肠杆菌合成牡荆素和荭草苷的应用，属于生物工程技术领域。本发明构建了一株能充足供应糖基供体UDPG的菌株，通过使用CRISPR‑Cas9系统敲除糖酵解途径关键基因pgi和zwf，以及敲除了UDPG合成路径的旁路基因ugd，gcd和otsA；使用pETDuet‑1质粒过量表达大肠杆菌内源的UDPG关键基因磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm)和UTP‑葡萄糖‑1‑磷酸尿苷酸转移酶(galU)，并使用pACYCDuet质粒游离表达UDP尿苷激酶(ndk)，构建一株能充足供应UDPG菌株，并在此菌株的基础上表达金莲花来源的8位碳苷糖基转移酶TcCGT1，以黄酮或其他类黄酮为底物用于合成糖基产物，在本发明中以木犀草素、芹菜素为例进行糖基产物牡荆素和荭草苷的发酵生产，最终，在5L发酵罐中牡荆素和荭草苷的产量分别达到17.25g/L和36.52g/L。

技术领域

本发明涉及工程大肠杆菌合成牡荆素和荭草苷的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

类黄酮是广泛分布于植物中的酚类化合物，基本骨架是一个15碳的苯丙烷核(C6-C3-C6)，它有A和B两个芳环，由一个杂环吡喃环(C)连接。由于糖链参与细胞分化、发育、免疫、衰老、信息传递等几乎所有生命过程，糖基化可以改变类黄酮的生物活性，增加水溶性，减少毒副作用，提高特异性。在自然界中类黄酮一般以糖苷的形式存在，类黄酮经过糖基化修饰后，通常表现出比其骨架更好的特性，甚至可能具有不同的特性。牡荆素和荭草苷是许多中草药的有效活性成分，牡荆素已知在许多癌症异种移植模型和细胞系中表现出广泛的抗氧化，抗炎，镇痛和抗肿瘤活性。荭草苷可以通过改善抗氧化防御机制来缓解小鼠由于电磁辐射引起的学习和记忆障碍，并且还具有抗心肌缺血、抗细胞凋亡、抗辐射、抗肿瘤和抗衰老等功能。

蔗糖合成酶能利用反应的副产物二磷酸尿苷(Uridine diphosphate，UDP)和蔗糖合成尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose，UDPG)。因此，将糖基转移酶和蔗糖合成酶耦合原位再生UDPG可有效降低反应成本。植物来源的蔗糖合成酶的偏好受体为UDP，因此，利用蔗糖合成酶和类黄酮糖基转移酶偶联反应的产物多为类黄酮葡萄糖苷。糖基转移酶和蔗糖合酶偶联反应虽然能提高UDP的利用次数，在一定程度上降低了生产成本，但反应体系中仍然需要添加UDP，并且前期需要对酶进行纯化，耗费大量精力，该生产方式并不是十分经济。微生物合成法具有反应条件温和、易于控制等优点，用于合成类黄酮糖苷具有较高潜力。

由于糖基供体UDPG合成的前体G-6-P绝大部分流入糖酵解途径，导致胞内UDPG浓度较低，并且UDPG在胞内参与多种代谢反应，进一步降低了UDPG在胞内的积累。目前针对胞内UDPG浓度过低的问题，主要是通代谢工程的手段强化UDPG前体G-6-P的供应，敲除糖酵解途径中的关键基因6-磷酸葡萄糖异构酶(pgi)和磷酸戊糖途径中的关键基因6-磷酸葡萄糖1-脱氢酶(zwf)，从而使G-6-P在流向UDPG合成。Eiteman等使用敲除pgi基因的工程菌并表达UGT73B3，用于合成槲皮素-3-葡萄糖苷，该方法也分别在槲皮素-3-鼠李糖苷，槲皮素-3-木糖苷，柚皮素-7-木糖苷，大黄素葡萄糖苷等。除了抑制消耗途径，UDPG合成通路基因的过表达也能提高类黄酮糖苷的生物合成。

在之前的工作中构建了糖基转移酶和蔗糖合成酶偶联的方法，并用于牡荆素和荭草苷的合成(《Efficient Production of Orientin and Vitexin from Luteolin andApigenin Using Coupled Catalysis of Glycosyltransferase and SucroseSynthase》)。酶偶联法虽然能提高UDP的利用次数，在一定程度上降低了生产成本，但仍然需要添加UDP，并不十分经济。大肠杆菌拥有内源UDPG合成路径，如果能强化该途径，构建一株能充足供应UDPG的工程菌，对糖基化产物合成具有积极意义。

发明内容