[发明专利]利用大肠杆菌P450酶全细胞催化合成羟基化黄酮化合物的方法及应用

说明书

本发明公开了利用大肠杆菌P450酶全细胞催化合成羟基化黄酮化合物的方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过筛选出高产羟基化黄酮化合物的P450sca‑2subgt;mut/subgt;、通过还原伴侣工程、酶工程以及全细胞催化条件优化，使sca‑2subgt;mut/subgt;R88A/S96A催化柚皮素合成圣草酚的效率达到77％；催化二氢山奈酚合成二氢槲皮素的效率达到66％；催化芹菜素合成木犀草素的效率达到32％；催化大豆苷元合成7,3',4'‑三羟基异黄酮的效率达到75％，为提高羟基化化合物的生物合成提供了新的策略。

技术领域

本发明涉及利用大肠杆菌P450酶全细胞催化合成羟基化黄酮化合物的方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

细胞色素P450酶是一类以血红素为辅基的酶，广泛存在于动植物、古生菌、细菌和真核生物等生物体内。在哺乳动物如人体内，P450酶广泛参与异源物质降解、解毒作用、药物代谢以及甾体类激素和维生素的合成。在植物中，P450酶能够催化一系列天然产物(如：萜类、多烯类、糖肽类、生物碱类、脂肪酸类、类固醇类)发生区域或立体的羟基化、环氧化、脱烷基、脱卤素等氧化催化反应。由于P450酶具有广泛的底物谱和催化反应的多样性，大量的P450酶逐渐被应用到微生物制药领域用来合成有价值的天然产物或者药物。以往的研究多采用胞外酶促催化方法，该方法往往需要对P450酶及辅酶进行纯化，而且需要额外添加昂贵的辅因子NAD(P)H和辅因子循环系统，催化合成成本较高。与胞外酶促催化方法相比，全细胞催化方法是催化成本低的替代方法。

黄酮类化合物是一类广泛存在植物中的多酚化合物，它们具有基本母核2-苯基色原酮(C6-C3-C6结构)，按照母体结构可以分为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮等(图1)。黄酮类化合物具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性，在食品医药领域应用广泛。然而，黄酮化合物水溶性差且不稳定限制了其在医药上的应用。羟基化反应不仅可以提高黄酮类化合物溶解性和稳定性，还可以增强其生物活性和丰富黄酮类化合物的种类。

与化学羟基化反应相比，生物催化羟基化反应是一种获得羟基化黄酮化合物环境友好型的方法。大肠杆菌是重组蛋白最常用的表达系统和高效的全细胞转化系统，而参与羟基化反应的P450酶在原核生物中可溶性差、表达困难。目前发现在大肠杆菌中表达CYP107P2(Pandey et al.,Enzyme Microb.Technol.48(4-5),386-392.2011)、CYP107Y1(Pandey et al.,Enzyme Microb.Technol.48(4-5),386-392.2011)、P450BM3(Chu etal.,Microb.Cell Fact.15(1),135.2016)、CYP105D7(Liu et al.,J.Mol.Catal.B:Enzym.132,91-97.2016)和CYP105A5(Subedi et al.,Catalysts 12(10),1157.2022)可以对特定的黄酮化合物进行羟基化，但是存在转化率低等问题。因此，开发能在原核生物中高效表达的P450酶用来合成黄酮类化合物有着重要的意义。

发明内容

本发明提供了细胞色素P450酶突变体P450sca-2，是以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为出发序列，进行了如下任意一种改进：

(1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第88位的精氨酸突变为丙氨酸；

(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第96位的丝氨酸突变为丙氨酸；

(3)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第88位的精氨酸突变为丙氨酸，并将第96位的丝氨酸突变为丙氨酸。

本发明还提供了编码所述突变体的基因。

本发明还提供了表达所述细胞色素P450酶突变体P450sca-2或SEQ ID NO.1所示细胞色素P450酶的重组大肠杆菌。