[发明专利]基于KASP技术开发的特异性分子标记用于南丰蜜桔蜜广1号品种鉴定

说明书

本发明公开了一种鉴定南丰蜜桔蜜广1号品种的分子标记引物，基于KASP技术开发的核心SNP标记引物可以将蜜广1号、桂橘一号和火桔与其他南丰蜜橘品种区分，再结合SSR引物在蜜广1号、桂橘一号和火桔的多态性扩增条带，可快速鉴定出蜜广1号，该引物可应用于南丰蜜桔蜜广1号辅助鉴定和验证种苗纯度等方面。

技术领域

本发明属于遗传育种及分子生物学技术领域，具体为鉴定南丰蜜桔‘蜜广1号’品种的分子标记引物及应用。

背景技术

南丰蜜桔(Citrus reticulate‘Kinokuni’)是原产于我国的地方特色桔类品种，因其果小皮薄、汁多无渣、味甜易剥等特点享有“桔中之王”的美誉。南丰蜜桔作为我国宽皮橘类中的优良品种常年出口至东南亚等国家，为南丰当地果农带来了颇为可观的种植收益。南丰蜜桔栽培历史悠久，经长期的自然发展于原产地周边形成了丰富的变异资源，诸如‘早熟系’、‘桂花蒂’、‘大果系’、‘小果系’、‘南丰红广’和‘南丰蜜广1号’等品系。不同品系南丰蜜橘间的外观相似，单从形态学上难以进行分辨，直接限制了南丰蜜橘品种的优化利用。因产业结构调整，南丰县联合地方农业科研部门对全县柑橘种植资源类型进行调查，初步将南丰蜜桔分为传统南丰蜜橘和带有南丰蜜橘血统的南丰广橘两大类。蜜广1号品系就属于南丰广橘一类，其具有早结丰产、抗逆性强、汁多化渣等特点。但因裂果较严重，在早期仅为零星种植。1989年南丰遭遇极端低温冻害，当地南丰蜜桔株系大面积受冻死亡。蜜广1号品系抗寒性较强，受冻情况较轻，随即受到了科研部门的重视并开始对蜜广1号品系进行选优。经过连续十余年的选育，现已形成稳定品质产量特性的优良蜜广1号蜜橘品种。但受限于早期鉴定技术，南丰蜜桔各品系混杂，同名异物、同物异名的问题十分普遍，同时市场上假冒伪劣蜜广1号种苗和果实的现象十分严重，严重侵害了种植户与消费者的权益。因此，目前迫切需要可稳定用于快速区分蜜广1号品种的鉴定方法。

目前多数柑桔新品种均来源于自然芽变，如何准确、快速地对芽变材料进行鉴定，这对于新品种保护及推广具有重要意义。传统鉴定芽变材料的方法主要通过形态学、细胞学和生化层面进行的，但存在着易受环境干扰、多态性较差以及区分度不高等弊端。鉴于市场中苗木品质良莠不齐和苗木不纯等现象频发，目前仅借助传统的鉴定技术已无法满足新品种鉴定需求，限制了产业良性发展。

分子标记技术直接以DNA序列差异为研究对象，从分子层面反映遗传物质的变化，与其它鉴定方法相比具有高效性、便捷性以及高多态性等诸多优良特性，SSR(简单重复序列标记)和SNP(单核苷酸多态性)均有变异位点丰富、多态性高、鉴定结果稳定可靠等特点，已逐渐成为芽变鉴定的首要手段。根据鉴定材料特性选择适宜的分子标记类型并建立对应的品种指纹图谱，可为后期品种真实性检测和苗木快速鉴定提供相应的技术支撑。分子标记技术的应用对于打击种苗假冒伪劣、保护育种人员和种植户利益、提高市场监管效率、维护产业健康发展具有重要意义。

KASP基因分型技术是基于引物末端碱基的特异性匹配、PCR技术和荧光检测对SNPs进行分型检测。KASP反应体系中包括2条特异性正向引物，正向引物的3'末端分别和SNP位点相对应，进行PCR扩增时相互竞争，5'末端分别添加特异荧光序列，还包括一条通用的反向引物。KASP相较于其他SNPs检测技术相比具有准确率高、稳定性好以及成本低等优点，已在柑桔、苹果、玉米等园艺作物品种鉴定上得到了广泛的应用。

南丰蜜桔‘蜜广1号’品种具有早结丰产、抗寒性强、汁多化渣等特点。其成熟期在11月上中旬，成熟时果实果皮色泽呈黄橙色，单果重约44.88克，可溶性固形物13～16％，可滴定酸0.68％，VC含量为25.64mg/100g，可食率77.59％，果实无籽。稳果后亩产可达3500公斤以上，丰产稳产性良好，大小年现象不明显。开发针对于‘蜜广1号’南丰蜜桔的特异性分子标记，有利于从分子水平上将该品种与目前主栽的南丰蜜桔品系进行区分界定，同时可为品种保护与快速鉴定提供技术支持。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种基于KASP技术开发的核心SNP标记引物并结合SSR分子标记技术共同用于南丰蜜桔‘蜜广1号’品种快速鉴定的方法。