[发明专利]一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种双酶偶联产N‑乙酰神经氨酸的高通量筛选方法。利用显色液可将酶催化反应生成的N‑乙酰神经氨酸，由无色快速转变为紫色，且于580nm处产生吸光值的变化这一特点。对以N‑乙酰葡萄糖胺、丙酮酸钠、N‑乙酰神经氨酸裂合酶、tritonx‑100为底物，再加入N‑乙酰葡萄糖胺异构酶反应生成的含有N‑乙酰神经氨酸的反应液进行高通量筛选，发现只需将反应液稀释至0.355mM左右就可对突变菌高通量快速进行筛选。本发明具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，对N‑乙酰葡萄糖胺异构酶的定向进化具有指导意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法。

背景技术

N-乙酰葡萄糖胺异构酶是催化N-乙酰葡萄糖胺生成N-乙酰甘露糖胺的酶，N-乙酰甘露糖胺是生产N-乙酰神经氨酸的中间体。利用N-乙酰葡萄糖胺异构酶催化合成N-乙酰神经氨酸，反应条件温和，绿色环保且无污染物生成，在生物催化和生物医药领域都有广泛的应用。

新型酶的发现可以通过自然突变的方法筛选得到，但是这种方法效率低、目标性较差，需建立快速高效的新方法。利用分子技术，筛选获得新型的N-乙酰葡萄糖胺异构酶。用分子改造的方法对现有的酶进行突变时，通常会形成数量巨大的文库，从而高通量检测方法成为筛选时的关键方法。目前使用较普遍的筛选方法为高效液相色谱(HPLC)，液相检测结果准确，但对于高通量筛选而言，其耗时较长，不利于筛选。

因此，开发一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法对N-乙酰葡萄糖胺异构酶的定向进化具有指导意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法，具体的是利用N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰葡萄糖胺异构酶生成中间体N-乙酰甘露糖胺，再将N-乙酰甘露糖胺和丙氨酸通过N-乙酰神经氨酸裂合酶生成的N-乙酰神经氨酸的96孔板检测筛选方法。

本发明的原理是利用间苯二酚显色反应是酮糖特有的反应。单糖能够与浓的硫酸、盐酸作用，脱水，从而形成糠醛或者糠醛的衍生物，在一定条件下糠醛及其衍生物能够与酚类，蒽酮类等缩合，生成各种有颜色的物质。通过间苯二酚与N-乙酰神经氨酸在特定条件下结合生成络合物，然后通过酶标仪在特定波长580nm条件下检测其吸光，颜色由无色变为紫色，将其运用于高通量筛选。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法，包括如下步骤：

(1)分别构建表达N-乙酰葡萄糖胺异构酶和N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因工程菌，并通过体外诱导表达分别收集N-乙酰葡萄糖胺异构酶和N-乙酰神经氨酸裂合酶的菌体；

(2)在离心管中分别加入底物N-乙酰葡萄糖胺、丙酮酸钠、步骤(1)得到的N-乙酰神经氨酸裂合酶和tritonx-100，然后再加入步骤(1)得到的N-乙酰葡萄糖胺异构酶混合均匀；

(3)将步骤(2)混合均匀的离心管置于高通量摇床中反应，离心收集上清液，即为含有N-乙酰神经氨酸的反应液，将反应液进行液相检测；

(4)将步骤(3)获得的反应液稀释，再加入显色剂在96深孔板中水浴反应后，转入酶标板中测定580nm吸光度，并根据吸光度数值及N-乙酰神经氨酸标准曲线检测N-乙酰神经氨酸的产量。

其中，步骤(1)中，所述的构建表达N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因工程菌，序列来自于Anabaena sp.CH1中的anAGE基因。

其中，步骤(1)中，所述的构建表达N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因工程菌，序列来自于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的N-acetylneuraminic acid lyase，即CgNal基因。