[发明专利]一种用于检测烟草青枯病菌的生物传感器及其制备方法

说明书

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种用于检测烟草青枯病菌的生物传感器及其制备方法。具体策略是将与烟草青枯病菌保守序列RipTALI‑9基因的互补DNA片段5'端修饰上电活性物质亚甲基蓝(methyleneblue,MB)后作为DNA探针，核酸外切酶III(ExoIII)作为信号产生和信号放大的生物元素，锡‑铟氧化物(indiumtinoxides，ITO)电极作为信号输出元件，实现生物传感器对烟草青枯病菌的检测。本发明提供的生物传感器可以实现对烟草青枯病菌简便，高效，低成本的检测。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种用于检测烟草青枯病菌的生物传感器及其制备方法。本发明具体提供了一个基于均相电化学以及核酸外切酶III(ExoIII)辅助循环放大的烟草青枯病菌生物传感平台用于烟草青枯病菌的快速准确检测。

背景技术

植物青枯病是由青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)引起的，青枯病是最严重的植物病害之一，青枯病菌可以严重侵害多种植物，其中包括许多重要的经济作物，如烟草、花生、马铃薯、番茄和大豆等，会严重影响国家的农业经济发展。

青枯病菌有高度的多样性，种属非常多，而烟草青枯病是由R.solanacearum属I系型菌株引起的，该菌株对烟草的危害极大，它从土壤中通过根伤口或自然开口侵入烟草植物，到达血管定植，导致烟草枯萎甚至死亡，这对我国的烟草生产构成了严重的威胁。目前为了研究烟草青枯病，许多方法已被用来检测青枯病菌，包括聚合酶链式反应(PCR)，生理生化检测法，酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫荧光集落染色法(IFC)，免疫条带法等，这些方法虽然都具有较高的敏感性，但是也具有一定的缺陷，比如假阳性概率和检测成本相对较高，需要昂贵的设备和技术以及专业的操作人员，检测耗费时间也较长。生物传感器是目前分析化学领域最常用的一类新型分析方法，生物传感器主要包含了三个关键要素：识别元件、信号转换器和信号输出元件，利用电化学或者生物化学的方法，目标物与识别元件之间发生反应，并将这些反应转换成电信号或者光信号等从而传达出来，生物传感器又可以根据其传感器元件不同可分为电化学生物传感器、免疫传感器、组织传感器和微生物传感器等。截至目前，仅有1例利用生物传感器检测烟草青枯病菌的方案被报导。这一例是由SaeedHoseinzadeh等人在2017年所报道的。他们合成了AuNPs，利用比色法检测青枯病菌。在有目标青枯病菌DNA存在的情况下，AuNPs探针在加酸后稳定存在并产生红色。当不存在青枯病菌DNA时，AuNPs探针失去稳定性并趋于聚集显示紫色。此技术缺少循环放大信号的部分，相对来说，其检测灵敏度较低。因此，开发快速、准确、操作简便、无需精密设备的青枯病菌检测技术具有重要的实际意义。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种用于检测烟草青枯病菌的生物传感器及其制备方法，利用已报导的烟草青枯病菌RipTALI-9基因(GenBank accessionNo:LN874053.1)，设计出与其互补的序列，通过对该互补序列末端进行电活性分子的修饰，成功制备出烟草青枯病菌生物传感器，通过检测烟草青枯病菌DNA实现了对烟草青枯病菌快速、准确的检测。

本发明提供的一种用于检测烟草青枯病菌的生物传感器，包括信号识别元件，信号转换器，信号输出元件三部分，其中由亚甲基蓝MB分子修饰过的与烟草青枯病菌基因组DNA序列互补的MB-cDNA片段作为信号识别元件，外切酶ExoIII作为信号产生及信号循环放大器，锡-铟氧化物ITO电极作为信号输出元件；

进一步的，所述的一种用于检测烟草青枯病菌的生物传感器检测时在电压-0.21V的位置出现差分脉冲伏安电化学信号峰。

本发明提供的一种用于检测烟草青枯病菌的生物传感器制备方法，包括以下步骤：

(1)将1170ng/mL的烟草青枯病菌基因组DNA用pH值为5.5-9.5的Tris-HCl缓冲液溶解，加到离心管中，震荡2min，使烟草青枯病菌基因组DNA充分伸展；