[发明专利]一种柠檬酸壳聚糖水凝胶的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种柠檬酸壳聚糖水凝胶的制备方法及其应用。首先通过两步合成法制备柠檬酸‑壳聚糖，先制备柠檬酸酐，再将壳聚糖与柠檬酸酐反应，制备柠檬酸壳聚糖；柠檬酸‑壳聚糖再与β甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素水溶液反应制备得到柠檬酸壳聚糖水凝胶。本发明制备得到的柠檬酸壳聚糖水凝胶，是一种抗氧化可注射可降解的壳聚糖水凝胶，应用于可注射性心肌组织工程中细胞移植的支架材料，其对心肌原代细胞具有良好的黏附性，提高移植细胞的滞留率，能够有效对抗梗死部位的氧化应激环境，清除移植部位的活性氧自由基，可支持心肌细胞在其内部的存活。

技术领域

本发明涉及水凝胶制备及应用领域，特别是涉及一种柠檬酸壳聚糖水凝胶的制备方法及应用。

背景技术

心肌梗死等心脏疾病严重威胁着人类的生命安全与健康，其发病率和死亡率在全球范围内处于逐年上升的势态，现有的治疗手段均存在着一定缺陷。随着组织工程学研究的不断深入，运用心肌细胞移植技术为受损心脏的细胞重建提供了一种全新的治疗方法。然而，由于梗死处局部缺血造成的活性氧自由基堆积等不适微环境，致使细胞移植后成活率和滞留率较低。

可注射心肌组织工程是指将可注射性支架材料与细胞和/或生长因子复合后，注射到受损部位进行心肌修复的一种方法，该方法可以提供一个三维的生长空间，从而提高细胞的存活率，由于其创伤小已成为心肌组织工程研究的热点之一。细胞支架不仅可以代替或修复受损伤的细胞外基质，还可以调节心肌梗死发生时心脏的微环境，满足细胞生长的环境要求。

可注射水凝胶是一种理想的传递细胞的支架材料，高水含量赋予其与组织相似的杨氏模量和离子电导率，它可以模拟心肌细胞外基质，降低左心室壁压力，抑制心肌梗死后左心室的重构，提供适合细胞生存的微环境，使被移植的细胞黏附、成活、募集、增殖和成熟，进而修复心肌功能。

壳聚糖是一种天然的阳离子聚合物，也是天然多糖中唯一的碱性多糖。壳聚糖作为一种天然生物材料，具有生物相容性、生物黏附性、生物降解特性及抗氧化活性等，常作为可注射支架材料广泛应用于组织工程等领域。一般来说，壳聚糖的抗氧化活性强弱与其分子量有关，分子量越高其抗氧化活性越弱，然而，高分子量的壳聚糖形成凝胶的能力强，因此，如何提高高分子壳聚糖的抗氧化能力是壳聚糖类水凝胶应用于可注射性心肌组织工程所面对的一大难题。

无水柠檬酸外观为白色的颗粒或白色结晶状粉末，可溶于水、醇和乙醚。其价格低廉，易于购买，是一种三元羧酸，羧基具有很好的反应活性，可以与壳聚糖上的氨基发生酰化反应。柠檬酸是机体三羧酸循环的组成部分，存在于所有动物组织中，作为氧化代谢的媒介物质。柠檬酸的羧基可以螯合金属离子，进而减少自由基的产生，有望应用于组织工程领域，另外，也可作为自来水中金属离子的吸附剂应用。柠檬酸壳聚糖可以增加壳聚糖的抗氧化性，且不影响其成凝胶特性，能对抗细胞移植处的氧化应激状态，为细胞移植提供一种适宜的生存环境，可作为心肌组织工程中细胞移植支架材料。

中国专利“一种柠檬酸接枝壳聚糖水凝胶的制备方法”(公布号：CN103992501B)制备的柠檬酸接枝壳聚糖水凝胶主要提供了一种易溶于水并具有高强度的壳聚糖水凝胶。而中国专利“一种柠檬酸交联壳聚糖水凝胶及其制备方法”(公布号：CN108341977B)制备的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶主要应用于脊髓损伤的修复。目前，均未有报道柠檬酸壳聚糖水凝胶应用于心肌组织工程中细胞移植支架材料中。

目前，柠檬酸壳聚糖水凝胶的制备方法多为物理交联法，如中国专利“一种柠檬酸接枝壳聚糖水凝胶的制备方法”(公布号：CN103992501B)，就是壳聚糖与柠檬酸通过氨基与羧基之间的静电吸引而形成物理交联制得。这种方法反应结合力较弱，柠檬酸易于掉落，形成的复合物的稳定性差，易受离子、pH等因素的影响而发生性质的变化。另一件中国专利“一种柠檬酸交联壳聚糖水凝胶及其制备方法”(公布号：CN108341977B)是通过交联剂EDC/NHS、京尼平或戊二醛溶液将壳聚糖交联，这种方法易导致壳聚糖分子间的氨基发生交联结合，形成更大分子量的壳聚糖聚合物，不能够保证柠檬酸与壳聚糖之间单分子连接，进而形成的产物均一性差。