[发明专利]大肠杆菌及其在催化合成阿洛酮糖中的应用

说明书

本发明公开了一种用于阿洛酮糖生物合成的大肠杆菌，敲除大肠杆菌的FruA基因，在大肠杆菌的基因组上插入cfa、ibpA和ibpB基因，以及DPEase重组基因，使得DPEase蛋白产物锚定在大肠杆菌细胞表面。还公开了其制备方法、CRISPR质粒A和B以及相应的转座酶体系。本发明敲除了大肠杆菌的FruA基因，降低了果糖的非目的性消耗。并插入cfa、pA和ibpB基因，然后对FruA缺失的大肠杆菌菌株进行了耐高温和耐高果糖的驯化，以提高大肠杆菌宿主在催化环境(55℃)中的稳定性。利用酶锚定技术将阿洛酮糖异构酶锚定在大肠杆菌的表面，使得阿洛酮糖异构酶在大肠杆菌表面生长，并催化外界环境中的果糖转化成阿洛酮糖。

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌及其在催化合成阿洛酮糖中的应用。

背景技术

阿洛酮糖(D-Psicose)属于一种酮糖，是由D-果糖在C-3位置差相异构形成的一种重要稀有糖，有近似蔗糖的甜味，但与蔗糖相比，阿洛酮糖的热量极低，被认为是食品的理想蔗糖替代品，可以用作食品和膳食补充剂中的成分。而阿洛酮糖在人体内经过肠道吸收后几乎不发生代谢、不产生能量，且很少被肠道微生物发酵利用，此特性也是其作为替代型甜味剂的主要原因。不仅如此，阿洛酮糖可以通过抑制α-葡萄糖苷酶从而减少葡萄糖的吸收，可控制血糖浓度的升高。阿洛酮糖被认为是食品的理想蔗糖替代品，且它具有重要的生理功能，如血糖抑制作用，清除活性氧和神经保护作用。由于阿洛酮糖是一种罕见的糖，在自然界中纯在的量非常的少。人们发现阿洛酮糖异构酶(D-Psicose-3-epimerase,DPEase)可以催化D-果糖异构化为稀有糖——阿洛酮糖。尽管在许多物种中发现能够表达阿洛酮糖异构酶，但自然宿主中表达的阿洛酮糖异构酶蛋白量极低，无法产生阿洛酮糖。因此通过基因工程细菌在体外表达重组的阿洛酮糖异构酶蛋白，以提高阿洛酮糖的转化率，成为阿洛酮糖生物合成领域的主流方法。但是，目前发现的阿洛酮糖异构酶都是嗜热型蛋白，最适反应温度在55-65℃，反应底物一般是500-700g/l的果糖。这种高温高渗条件对酶以及其表达宿主的稳定性都是很大的挑战。此外，果糖作为宿主可以利用的碳源之一，容易进入宿主细菌代谢，而不参与阿洛酮糖的合成。

发明内容

本发明主要目的是获取一种大肠杆菌，可用于催化阿洛酮糖的合成。

本发明公开了一种CRISPR质粒A，所述CRISPR质粒A包含crRNA、LE、RE、cfa、ibpA和ibpB基因，所述crRNA靶向FruA。

优选的，该质粒的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还公开了一种转座酶体系，包括上述的CRISPR质粒A，以及转座酶质粒；

所述转座酶质粒包含TnsA、TnsB、TnsC、TniQ、Cas6、Cas7和Cas8蛋白的编码基因。

优选的，转座酶质粒的序列如SEQ ID:No.1所示。

本发明还公开了一种CRISPR质粒B，所述CRISPR质粒B包含crRNA、LE、RE、DPEase重组基因，其中DPEase重组基因的核苷酸序列见SEQ ID NO:7。

优选的，其序列如SEQ ID:No.5所示。

本发明还公开了一种用于阿洛酮糖生物合成的大肠杆菌，敲除大肠杆菌的FruA基因，在大肠杆菌的基因组上插入cfa、ibpA和ibpB基因，以及DPEase重组基因，使得DPEase蛋白产物锚定在大肠杆菌细胞表面。

优选的，所述大肠杆菌经诱变和高温度培养条件下驯化处理。

优选的，诱变的方式为等离子诱变、微波诱变、电离辐射诱变、紫外诱变、硫酸二乙酯诱变、亚硝基胍诱变中的一种或者多种组合；