[发明专利]一种牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂及使用方法

说明书

本发明适用于生物鉴定技术领域，提供了一种牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂，包括一对检测蓟马COⅠ基因序列设计的引物：olotCOⅠ‑F：5‑ATATTAGGAGCTCCAGATATAGC‑3；olotCOⅠ‑R：5‑GGGTGACCAAAAAATCAAAATAA‑3；还包括在牛角花齿蓟马序列中设计的酶切位点BclⅠ。通过根据蓟马属种之间线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因序列差异性，寻找牛角花齿蓟马和端大蓟马的物种特异性变异位点，建立对这些蓟马种的分子鉴定体系，最终实现蓟马及其近缘种的快速、准确和高效地鉴定。

技术领域

本发明属于生物鉴定技术领域，尤其涉及一种牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂及使用方法。

背景技术

植食性蓟马是重要的农业害虫。蓟马的体长一般介于0.5～2.0mm，多数用肉眼无法分辨，经常造成种间混淆。目前对蓟马的鉴定，主要依据形态学特征进行判定，例如：体色、触角节数、鬃毛的数量及形态等。牛角花齿蓟马(Odontothripsloti)和端大蓟马(Megalurothrips distalis)同属于蓟马亚科，形态相似，体棕色，触角8节，节I具有1对背顶鬃，前足胫节暗黄色，前翅灰暗，基部约1/7无色透明，腹部背板节VIII两侧具有后缘梳，腹板节VII中对后缘鬃位于后缘之前；区别在于端大蓟马触角与体色一致，前翅前脉端鬃3根；牛角花齿蓟马触角节Ⅲ为黄色，前翅前脉端鬃2根。以上特征只有经验丰富的工作者借助显微镜才能加于区分，稍有不慎就会造成混杂，加大了田间采集与区分的难度。

线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ基因)是动物中普遍存在的保守基因，因其序列高度保守性和种间足够变异，在物种鉴定和进化分析方面广泛应用。分子鉴定的方法已被应用于缨翅目昆虫的鉴定，通过测序以及遗传距离的测定方法，存在耗时、费用高以及技术难度高等问题，目前尚无快速简便的分子标记方法用于田间易混杂蓟马的鉴定方法。因此如何快速准确的对形态相似，混杂寄生的蓟马种群进行鉴定，已成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂及使用方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂，包括一对检测蓟马COⅠ基因序列设计的引物：

olotCOⅠ-F：5-ATATTAGGAGCTCCAGATATAGC-3

olotCOⅠ-R：5-GGGTGACCAAAAAATCAAAATAA-3；

还包括在牛角花齿蓟马序列中设计的酶切位点BclⅠ。

进一步的技术方案，所述分子鉴定试剂还包括由A液：B液：C液＝8：1：1配制而成的匀浆液，所述A液包括0.05mol/L的Tris base，0.1mol/L的NaCl，以及0.1mol/L的EDTA，所述A液的pH为7.6，所述B液为5％的SDS，所述C液为2mg/mL的蛋白酶K。

本发明实施例的另一目的在于，一种牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂的使用方法，包括以下步骤：

步骤1、蓟马总DNA提取：

分别取单头蓟马置于1.5ml离心管中，加入现配制的分子鉴定试剂200μl，充分研磨，再次加入400μl的分子鉴定试剂混匀，使终体积为600μl；45℃水浴加热1h至组织消化完全，加入600μl的Tris饱和酚，轻摇10min混匀，7000r/min室温离心10min，取上清液至新的离心管中；加入550μl的三氯甲烷和异戊醇(24：1)混合液，轻摇10分钟混匀，8000r/min室温离心10min，取上清液至新的离心管中；加入1ml预冷的无水乙醇溶液，12000r/min室温离心10min，弃上清；加入500μl预冷的70％的无水乙醇溶液，轻弹离心管底部使DNA沉淀悬浮，12000r/min室温离心10min，弃上清；自然干燥，加入适量ddH₂O溶解，保存于-20℃备用。