[发明专利]一种牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂及使用方法

权利要求书

1.一种牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂，其特征在于，包括一对检测蓟马COⅠ基因序列设计的引物：

olotCOⅠ-F：5-ATATTAGGAGCTCCAGATATAGC-3

olotCOⅠ-R：5-GGGTGACCAAAAAATCAAAATAA-3；

还包括在牛角花齿蓟马序列中设计的酶切位点BclⅠ。

2.根据权利要求1所述的牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂，其特征在于，所述分子鉴定试剂还包括A液：B液：C液＝8：1：1配制而成的匀浆液，所述A液包括0.05mol/L的Trisbase，0.1mol/L的NaCl，以及0.1mol/L的EDTA，所述A液的pH为7.6，所述B液为5％的SDS，所述C液为2mg/mL的蛋白酶K。

3.一种如权利要求1和2任一项所述的牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、蓟马总DNA提取：

步骤2、PCR扩增：

以DNA为模板，根据序列号为MG521378.1的齿蓟马属COⅠ基因序列设计引物：

olotCOⅠ-F：5-ATATTAGGAGCTCCAGATATAGC-3

olotCOⅠ-R：5-GGGTGACCAAAAAATCAAAATAA-3；

使用1％的琼脂糖凝胶，在120V电压下电泳20min，在凝胶成像系统观察电泳条带，PCR产物进行测序；

步骤3、酶切分析：

利用DNAMANV6在牛角花齿蓟马序列中设计酶切位点BclⅠ；

37℃水浴30min，使用1％的琼脂糖凝胶，在120V电压下电泳20min，在凝胶成像系统观察电泳条带。

4.根据权利要求3所述的牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂的使用方法，其特征在于，所述步骤1的具体步骤如下：

分别取单头蓟马置于1.5ml离心管中，加入现配制的分子鉴定试剂200μl，充分研磨，再次加入400μl的分子鉴定试剂混匀，使终体积为600μl；45℃水浴加热1h至组织消化完全，加入600μl的Tris饱和酚，轻摇10min混匀，7000r/min室温离心10min，取上清液至新的离心管中；加入550μl的混合液，轻摇10分钟混匀，8000r/min室温离心10min，取上清液至新的离心管中；加入1ml预冷的无水乙醇溶液，12000r/min室温离心10min，弃上清；加入500μl预冷的70％的无水乙醇溶液，轻弹离心管底部使DNA沉淀悬浮，12000r/min室温离心10min，弃上清；自然干燥，加入适量ddH₂O溶解，保存于-20℃备用。

5.根据权利要求4所述的牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂的使用方法，其特征在于，在所述步骤1中，三氯甲烷：异戊醇＝24：1。

6.根据权利要求3所述的牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂的使用方法，其特征在于，在所述步骤2中，PCR构建反应体系如下：

7.根据权利要求3所述的牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂的使用方法，其特征在于，在所述步骤2中，PCR反应程序为：

8.根据权利要求3所述的牛角花齿蓟马和端大蓟马的分子鉴定试剂的使用方法，其特征在于，在所述步骤3中，构建的酶切体系如下：