[发明专利]一种PRV含量的检测方法

说明书

本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)含量的检测方法，即免疫印迹法(Western Blot，WB)，通过制备的PRV标准品和PRV待测品；用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)法分离PRV；将分离的PRV从电泳凝胶转移至PVDF膜上；封闭，与制备的PRV单克隆抗体(一抗)和HRP标记的二抗反应后显色；以PRV标准品与对应灰度值建立标准曲线，并根据标准曲线方程计算待测品病毒含量。该方法不仅可以快速定量PRV待测品的病毒含量，还不涉及常规毒力检测中细胞培养、铺板、接毒、观察等繁琐、费时的技术操作过程，更可规避可能存在的强毒扩散的生物风险，达到省时、省力、安全、高效检测PRV病毒含量的目的。

技术领域

本发明涉及病毒含量检测技术领域，特别涉及一种PRV含量的检测方法。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一种猪的急性传染病，PRV属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，猪疱疹病毒属，线性DNA病毒，电镜显示该病毒呈圆形或椭圆形，直径为150nm～180nm，囊膜表面有长约8nm～10nm呈放射状排列的纤突，从外到内由脂质双层膜形成的囊膜、20面体核衣壳和核心构成。囊膜上有免疫后能产生保护性中和抗体的结构蛋白，也有PRV感染宿主细胞过程中发挥作用的蛋白。目前研究发现：g C、g E、g I、g G、g M和g N基因编码的是病毒复制中的非必须蛋白，与病毒的毒力的有关，它们的缺失不影响病毒在体外的复制；g E基因与病毒在细胞间传播和PRV增殖后释放有关，甚至可促进PRV对中枢神经系统中的侵入和扩散。另外发现g B、gD、g H、g K、g L是病毒增殖必需糖蛋白。

PRV感染后可引起仔猪呕吐、高热及神经症状，病死率高；母猪出现流产、产死胎和木乃伊胎为主的繁殖障碍；成年猪出现高热症状，耐过后通常呈隐性感染。该病毒具有潜伏感染的特点，感染宿主后可潜伏于外周神经系统中，当外界条件变化引起动物应激时，PRV会被激活引起宿主向外排毒，引起更多感染，使防控和净化难度增大，给养猪业带来巨大经济损失，免疫接种配合检测是防治伪狂犬病的主要策略。疫苗免疫是防控猪伪狂犬病的重要手段，在猪伪狂犬病疫苗的生产过程中，病毒含量是疫苗质控的重要指标，目前测定病毒含量的方法主要是采用组织细胞半数感染量(TCID₅₀)法，该方法耗时长，至少需要72小时；且只能检测活的病毒，存在生物安全隐患，在灭活疫苗的生产中，病毒灭活之后不能采用该方法测定病毒含量，给疫苗生产中的质量控制造成一定的困难。

因此，有必要开发一种快速定量检测PRV病毒含量的方法，以解决现存在的费时，费力，低效且不能测定灭活后的病毒等问题。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种PRV含量的检测方法，旨在有效解决TCID₅₀法操作复杂，技术要求高，耗时长，且只能检测活毒的缺陷。

为实现上述目的，本发明提出一种PRV含量的检测方法，所述PRV含量的检测方法采用免疫印迹法，所述PRV含量的检测方法包括以下步骤：

S1、对PRV标准品、PRV待测品分别用稀释液进行稀释，对应得稀释后的PRV标准品和稀释后的PRV待测品；

S2、将稀释后的PRV标准品、稀释后的PRV待测品分别进行预处理，再进行SDS-PAGE电泳分离后，转移到PVDF膜上；

S3、封闭PVDF膜，用PRV的特异性单克隆抗体进行孵育和洗膜后，再用HRP标记抗体进行孵育和洗膜，获得二抗洗膜后的PVDF膜；

S4、将所述二抗洗膜后的PVDF膜进行显色反应，得到PRV标准品的灰度值和PRV待测品的灰度值，根据PRV标准品病毒含量与对应的灰度值建立标准曲线，再根据所述标准曲线和PRV待测品的灰度值计算出所述PRV待测品中的PRV含量。

可选地，步骤S1中：所述稀释液为0.01mol/L PBS。