[发明专利]用于肺癌早筛的特异性甲基化引物及筛查方法

说明书

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于肺癌早筛的特异性甲基化引物及筛查方法，通过UCSC数据库调取与肺癌发生发展密切相关SHOX2基因和PTGER4基因序列，针对启动子CpG区域设计特异性引物和荧光探针，通过特异性甲基化PCR评价基因甲基化状态，可以区分肺癌患者与健康人群，筛查过程无创，简单，快捷，用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于肺癌早筛的特异性甲基化引物及筛查方法。

背景技术

肺癌的发病率和致死率已经逐年攀升，截至2021年底，全球范围内肺癌致死率占所有女性癌症死亡总数的22％，已经超越乳腺癌高居第二，占所有男性癌症死亡综述的22％，成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，每年由于肺癌所致的医疗费用超过千亿，防控形式严峻。

目前临床常用的肺癌早期检测的方法多集中在影像学检测，痰液，肺泡灌洗液检测，检测灵敏度有限，并不能在早期检测发现病灶，通过不同程度的临床干预后也无法明显降低死亡率。低剂量螺旋形计算机断层扫描技术具有更高的灵敏度，能够在甄别早期病灶，但检测方法的偏低的特异性会导致诊断假阳性检出，增加受试者心理压力，造成后期医疗资源的过度消耗。近年来，测序技术发展为分子诊断领域提供了更多的思路，肺癌早期诊断的分子标志无也层出不穷，例如：基因表达，结构变异，DNA甲基化，血液游离DNA片段化特征，末端结构等，转录因子结合位点分析等，其中基因甲基化则通过检测临床样品中特定基因的表观修饰，得到更早期，更稳定，检测结果，该方法可灵活应用于组织样本，血液，尿液等可用于液体活检的样品。因此，如何开发灵敏、特异的生物学标志物和检测技术，为肺癌早期筛查、肺癌诊断，预后监控具有很大的临床价值。

发明内容

针对以上述背景技术的不足，本发明提供一种用于肺癌早筛的特异性甲基化引物及筛查方法，采用荧光定量PCR技术，检测人外周血游离DNA中与肺癌发生和发展紧密关联的基因，评价基因甲基化状态从而达到早期诊断，早期筛查的目的。

一方面，本发明采用的技术方案如下：用于肺癌早筛的特异性甲基化引物，关键在于：包括与肺癌人群早期甲基化位点相关的2对靶标特异引物、2个特异性引物探针；其中所述2对靶标特异引物的序列如下：

Seq ID NO.1：F-TAACCCGACTTAAACGACGA，

Seq ID NO.2：R-GTTTTTTGGATAGTTAGGTAAT；

Seq ID NO.3：F-TGGGTATTGTAGTCGCGAGTTATC,Seq ID NO.4：R-CTACGTAAACAAACGATTAACG；

所述特异性引物探针序列如下：

Seq ID NO.5：FAM-CTCGTACGACCCCGATCG-BHQ1；

Seq ID NO.6：

TEXAS RED-CAATCTATACGTCCAACGTACTCTTTTACGCGCTA-BHQ2。

优选的，还包括对应的内参引物、内参引物探针；其中，所述内参引物的序列如下：

Seq ID NO.7：F-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT，Seq ID NO.8：R-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA；

内参引物探针序列如下：

SEQ ID NO.9：JOE-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1。

另一方面，本发明提供一种肺癌早期筛查方法，其特征在于包括以下步骤：

S1.提取血浆中游离的cfDNA；