[发明专利]基于PEMV-1和PEMV-2侵染性克隆高效筛选抗病毒种质资源的方法

说明书

本发明涉及一种基于PEMV‑1和PEMV‑2侵染性克隆高效筛选抗病毒种质资源的方法；包括：农杆菌浸根步骤。本发明具有以下优点：1、本发明方法操作简便，具有比人工摩擦接种更省时、更方便的优点；2、本发明方法可以通过调节侵染性克隆的浓度来控制病毒的接种量，同一批次的不同植株之间接种量误差小；3、本发明方法中一种侵染性克隆只具有一种病毒的侵染活性，解决了毒源不纯的问题，满足了要求特定病原接种的实验条件；4、本发明方法接种效果好，对植株的侵染率高；5、本发明方法使植株获毒时间早，病毒在植株体内积累的时间长；6、本发明方法成本相对较低，接种操作时间短。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及基于PEMV-1和PEMV-2侵染性克隆高效筛选抗病毒种质资源的方法技术领域。

背景技术

豌豆耳突花叶病毒1号(pea enation mosaic virus 1，PEMV-1)是Solemoviridae科耳突花叶病毒属(Enamovirus)的病毒，豌豆耳突花叶病毒2号(pea enation mosaicvirus 2，PEMV-2)是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)幽影病毒属(Umbravirus)的病毒，二者复合侵染引起豌豆耳突花叶病(Pea enation mosaic disease，PEMD)。PEMD分布广泛，在美国、德国、英国、法国、捷克等国家均有报道，曾导致英格兰的豌豆产量损失高达50％PEMV-1和PEMV-2在田间主要侵染豆科植物，包括豌豆、蚕豆、鹰嘴豆、大豆、菜豆在内的23种豆科植物。同时，PEMV-1和PEMV-2也会侵染非豆科植物，如番茄、辣椒、苦苣菜^[13]、千日红、本氏烟等。PEMV-1和PEMV-2侵染后造成植株生长扭曲，发育迟缓，花叶，叶片黄化并有坏死斑，叶脉褪绿，在叶背及豆荚上出现耳状突起，豆荚常畸形，结实率显著降低，导致严重损失。PEMV-1与PEMV-2都能独立进行自我复制。PEMV-1可以通过蚜虫以循回非增殖的方式传播，PEMV-2需要PEMV-1的CP进行包壳才能进行蚜虫传播，而PEMV-2可以协助PEMV-1进行系统侵染及机械传播。多种蚜虫都是PEMV(PEMV-1和PEMV-2)的传播介体，如豌豆蚜、豇豆蚜、桃蚜、茄蚜等，这些蚜虫在中国及世界范围内分布广泛，且种群数量大，因而致使PEMD具有较高的传播流行风险。

目前尚无报道防治PEMD有效的方法。据相关文献，使用杀虫剂来控制PEMD的病媒蚜虫收效甚微，因此，最好的防治方法是使用抗病品种。人工接种是抗病种质资源筛选和抗病育种的基础，也是研究病毒致病性、传播特性以及与病毒与媒介昆虫互作常用的方法。

传统的利用毒源人工摩擦接种豌豆有许多局限性，而病毒侵染性克隆是指利用基因重组技术把含有病毒全长基因组基因序列插入特定载体中获得具有侵染寄主的功能的重组载体。病毒通过注射接种的方式易于侵染植株，但注射接种存在着成本较高，操作繁琐等问题。发展更加高效、更方便的接种方法是侵染性克隆的一个方向，其对该病毒致病机制和抗病种质资源筛选等研究具有重要意义。

传统的摩擦接种技术存在着以下问题：费时费力，需要逐个摩擦叶片，一般每株植物摩擦两叶以上，摩擦后还要对接种植物进行清洗；

1、人工摩擦的力度难以把握，具有一定技术难度，如用力过重会导致细胞受损甚至植株死亡；

2、毒源不纯，直接研磨病叶获得的病汁液有可能存在两种或两种以上的病毒，无法达到单一病原接种的目的；

3、接种无法量化，同一批次的不同植株之间病毒接种量误差大，每次接种所蘸取的病汁液的量无法固定。

发明内容

本发明为解决上述问题缺陷，提供了一种基于PEMV-1和PEMV-2侵染性克隆高效筛选抗病毒种质资源的方法。本发明为研究该病毒致病性、传播特性以及病毒与媒介昆虫互作奠定了基础，解决了抗病毒豌豆种质资源筛选中的技术问题。

本发明采用如下技术方案实现。

一种用于检测PEMV-1的引物，所述引物为：