[发明专利]基于PEMV-1和PEMV-2侵染性克隆高效筛选抗病毒种质资源的方法

权利要求书

1.一种用于检测PEMV-1的引物，其特征在于，所述引物为：

PEMV-1-801-F：5’-AGTTCGTCCTGGTGTCCTGG-3’；

PEMV-1-801-R：5’-CATACCACTTCCCATCCCGC-3’。

2.一种用于检测PEMV-2的引物，其特征在于，所述引物为：

PEMV-2-483-F：5’-TTCAGGAGCACCCGAAACAC-3’；

PEMV-2-483-R：5’-CGTAGTGAGAGGCATGGCAT-3’。

3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于，反应体系为：5μL Tap mix、3.6μL ddH₂O、0.2μL Primer(For)和0.2μL Primer(Rev)，1μL cDNA；

反应程序为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。

4.一种用于扩增PEMV-1基因组的5′和3′端序列的引物，其特征在于，所述引物为：

PEMV-1 5'RACE-GSP：5'-GCGGTAGTTGAGGCTGCTCAATTCC-3'；

PEMV-1 3'RACE-GSP：5'-AGGCCAGGAGTTCTCTGCCTGTGAG-3'。

5.一种用于扩增PEMV-2基因组的5′和3′端序列的引物，其特征在于，所述引物为：

PEMV-2 5'RACE-GSP：5'-TACTGTCAGCATCGCGGCGCGCTCG-3'；

PEMV-2 3'RACE-GSP：5'-ACACCCTGCCACGAGGTGCGTGGA-3'。

6.一种用于扩增PEMV-1的方法，其特征在于，将PEMV-1分为三个片段：PEMV-1-1、PEMV-1-2和PEMV-1-3；使用引物组pCB301-PEMV-1-1F/PEMV-1-1R，PEMV-1-2F/PEMV-1-2R和PEMV-1-3F/pCB301-PEMV-1-3R分别扩增PEMV-1的片段PEMV-1-1、PEMV-1-2和PEMV-1-3；

PEMV-1的引物序列如下：

pCB301-PEMV-1-1F：

5’-AGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTGAAATAATTGTAAGAAAGCTCTAG-3’；

PEMV-1-1R：

5’-TTGTTACGAATCTTCTCCATCTTATGTGGTTCCAGC-3’；

PEMV-1-2F：5’-GGAACCACATAAGATGGAGAAGATTCGTAACAAGCGC-3’；

PEMV-1-2R：

5’-CGACCGAAAGTGGCAGACCCATTGGAACGA-3’；

PEMV-1-3F：

5’-ATGGGTCTGCCACTTTCGGTCGTGAAATTC-3’；

pCB301-PEMV-1-3R：

5’-GAGATGCCATGCCGACCCTGCGATATAATCCCATGAAAACGCTG-3’；所述方法的PCR扩增体系为20μL：5×PrimeSTAR GXL Buffer 4μL，dNTP mixture(2.5mM each)1.6μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase0.4μL，dd H₂O 10.8μL，cDNA 2μL；引物pCB301-PEMV-1-1F/PEMV-1-1R退火温度54.5℃，延伸3min；PEMV-1-2F/PEMV-1-2R退火温度60℃，延伸3min；PEMV-1-3F/pCB301-PEMV-1-3R退火温度60℃，延伸2min；反应程序为：98℃30s；98℃10s，Y℃15s，68℃Zmin；68℃10min；4℃保存。