[发明专利]靶向激活雌激素受体GPER在抗急性髓系白血病中的应用

权利要求书

1.一种实验性验证靶向激活雌激素受体GPER在抗急性髓系白血病方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)检测GPER在白血病中的表达情况：首先，利用Oncomine和Beat AML数据库分析白血病患者GPER的基因表达水平以及GPER在男性和女性患者中的表达是否存在差异；其次，利用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR),蛋白质印迹法(WesternBlotting)，免疫组化试验和免疫荧光试验检测白血病原代细胞和细胞系中GPER的表达水平和定位；最后，利用http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi网站和亚硫酸氢基因组DNA测序分析GPER的CpG岛上的甲基化位点,并用去甲基化药物5-Aza处理后检测GPER的mRNA表达水平。

(2)GPER特异性激动剂G-1对白血病细胞增殖和周期的影响：首先采用GPER的特异性激动剂G-1处理白血病细胞系、白血病原代细胞及健康人的外周血CD34+细胞，然后利用活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、5-乙炔基-2-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU)细胞增殖检测试剂盒和克隆形成试验检测白血病细胞增殖能力的改变。此外，采用不同浓度的G-1处理白血病细胞24h，再利用流式细胞术(flow cytometry，FCM)观察细胞周期的改变；进一步利用Western Blotting检测细胞周期相关蛋白的改变。(3)GPER特异性激动剂G-1对白血病细胞凋亡的影响：首先采用不同浓度的G-1处理白血病细胞系、白血病原代细胞及健康人的外周血CD34+细胞24h，再利用流式细胞术(flowcytometry，FCM)观察细胞凋亡的改变；其次，利用Western Blotting检测细胞凋亡相关蛋白的改变以及线粒体部分细胞色素C的释放情况。

(4)干扰或过表达GPER对G-1抑制白血病细胞增殖和促凋亡的影响：首先，利用shRNA慢病毒载体在OCI-AML2细胞系敲低GPER，然后用G-1处理白血病细胞，利用CCK-8检测细胞增殖，利用FCM检测细胞凋亡；并利用pcDNA3.1-EGFP/HA-GPER质粒在KG1a细胞系中过表达GPER，然后用G-1处理白血病细胞，利用CCK-8检测细胞增殖，利用FCM检测细胞凋亡。