[发明专利]用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种用于生产反式‑4‑羟基脯氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用，所述基因工程菌是一株不含质粒、从头合成高产反式‑4‑羟基脯氨酸的基因工程菌E.coli Hyp，具有遗传稳定性好、发酵产率高、糖酸转化率高等优势，所述基因工程菌以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合反式‑4‑羟基脯氨酸，发酵45h产量可高达129.2g/L，糖酸转化率为36.3％，具有很好的工业应用前景；该基因工程菌构建方法简单，首先对大肠杆菌中谷氨酸代谢网络中与反式‑4‑羟基脯氨酸的合成途径进行分析重构，加强了反式‑4‑羟基脯氨酸合成和积累；之后引入密码子优化后的指孢囊菌脯氨酸羟化酶基因，进一步加强反式‑4‑羟基脯氨酸合成。

技术领域

本发明涉及化合物生物技术及发酵工程技术生产领域，尤其是一种用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

反式-4-羟脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline)，羟脯氨酸由脯氨酸羟基化得到，关键酶为脯氨酸羟化酶，它是动物结构蛋白(如胶原蛋白和弹性蛋白)的天然成分，被广泛应用于医药、食品、饲料及化妆品领域。现如今，随着人们对羟脯氨酸功能研究的逐渐深入，其市场需求还在不断扩大。

反式-4-羟脯氨酸的生产方法主要有蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法，但前两种方法使用大量的酸碱试剂及有机试剂，存在提取困难、污染严重、价格昂贵等问题，无法满足生产的需求。

微生物发酵法是以廉价的葡萄糖为碳源进行微生物生产的高效方法，具有绿色环保、操作简单等优点，但往往发酵过程难以控制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种大肠杆菌菌株。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述大肠杆菌菌株的构建方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述大肠杆菌菌株的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌，命名为E.coli Hyp，所述基因工程菌E.coli Hyp是在野生型大肠杆菌的染色体基因组上敲除脯氨酸脱氢酶基因；染色体基因组上敲除脯氨酸转运蛋白基因；染色体基因组上敲除脯氨酸转运体基因；染色体基因组上敲除DNA结合转录抑制因子基因；染色体基因组上敲除异柠檬酸裂解酶基因；并分别在基因组mbhA位点和yghX位点上整合密码子优化(按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化)后的谷氨酸激酶基因proB(NCBI-Gene ID:946425)，并由Ptrc启动子(具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列)启动；在基因组yciQ位点上整合吡咯啉-5-羧酸还原酶基因proC(NCBI-Gene ID:945034)；并由同一个Ptrc启动子启动；分别在基因组yciT位点和ycgH位点上整合密码子优化后的谷氨酸半醛脱氢酶基因proA(NCBI-Gene ID:946680)，并由Ptrc启动子启动；在基因组ygaY位点上整合密码子优化后的脯氨酸羟化酶基因Hyp，并由Ptrc启动子启动；在基因组yeeP位点上整合密码子优化后的解酮酶基因XfP(NCBI-Gene ID:56674845))并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjiP位点上分段整合吡啶核苷酸转氢酶基因pntA(NCBI-GeneID:946628)和pntB(NCBI-Gene ID:886830)，并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjiV位点上整合透明颤菌血红蛋白基因vhB(NCBI-Gene ID:CP020373.1)，并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjgX位点上整合脯氨酸转运蛋白基因cgl2622(NCBI-Gene ID:CP025533.1)，并由同一个Ptrc启动子启动。

优选的，上述用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌，所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌E.coli W3110(ATCC 27325)。

优选的，上述用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌，所述脯氨酸羟化酶基因为密码子优化后基因Hyp。