[发明专利]用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌，其特征在于：命名为E.coli Hyp，所述基因工程菌E.coli Hyp是在野生型大肠杆菌的染色体基因组上敲除脯氨酸脱氢酶基因；染色体基因组上敲除脯氨酸转运蛋白基因；染色体基因组上敲除脯氨酸转运体基因；染色体基因组上敲除DNA结合转录抑制因子基因；染色体基因组上敲除异柠檬酸裂解酶基因；并分别在基因组mbhA位点和yghX位点上整合密码子优化后的谷氨酸激酶基因proB，并由Ptrc启动子启动；在基因组yciQ位点上整合吡咯啉-5-羧酸还原酶基因proC；并由同一个Ptrc启动子启动；分别在基因组yciT位点和ycgH位点上整合密码子优化后的谷氨酸半醛脱氢酶基因proA，并由Ptrc启动子启动；在基因组ygaY位点上整合密码子优化后的脯氨酸羟化酶基因Hyp，并由Ptrc启动子启动；在基因组yeeP位点上整合密码子优化后的解酮酶基因XfP并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjiP位点上分段整合吡啶核苷酸转氢酶基因pntA和pntB，并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjiV位点上整合透明颤菌血红蛋白基因vhB，并由同一个Ptrc启动子启动；在基因组yjgX位点上整合脯氨酸转运蛋白基因cgl2622，并由同一个Ptrc启动子启动。

2.根据权利要求1所述的用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌E.coliW3110。

3.权利要求1所述用于生产反式-4-羟基脯氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110染色体基因组进行定向改造，具体步骤如下：

(1)为了进一步增加脯氨酸的供应，阻断脯氨酸反馈抑制途径，对脯氨酸脱氢酶编码基因putA进行敲除；

(2)为了减弱脯氨酸向胞内积累，阻断脯氨酸向胞内运输，对脯氨酸转运蛋白编码基因proP进行敲除；

(3)为了减弱脯氨酸的内排途径，阻断脯氨酸向胞内运输，对脯氨酸转运体编码基因putP进行敲除；

(4)为了减少对Ptrc启动子的抑制，增强其表达效果，对DNA结合转录抑制因子编码基因lacI进行敲除；

(5)为了减弱α-酮戊二酸分支代谢途径，阻断乙醛酸代谢，对异柠檬酸裂解酶编码基因aceA进行敲除；

(6)为了进一步加强脯氨酸合成途径，将密码子优化后的谷氨酸激酶编码基因proB整合至大肠杆菌基因组的mbhA和yghX位点，并用Ptrc启动子控制转录；

(7)为了进一步加强脯氨酸合成代谢通路，将吡咯啉-5-羧酸还原酶编码基因proC整合至大肠杆菌基因组的yciQ位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；

(8)为了进一步加强脯氨酸合成途径，将密码子优化后的谷氨酸半醛脱氢酶编码基因proA整合至大肠杆菌基因组的yciT和ycgH位点，并用Ptrc启动子控制转录；

(9)为了加强反式-4-羟基脯氨酸合成途径，将密码子优化后的脯氨酸羟化酶编码基因Hyp整合至大肠杆菌基因组的yghX位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；

(10)为了加强谷氨酸合成途径，将密码子优化后的解酮酶编码基因xfP整合至大肠杆菌基因组的yeeP位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；

(11)为了加强细胞内NADPH供应，将吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntA和pntB整合至大肠杆菌基因组的yjiP位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；

(12)为了加强细胞内氧的代谢途径，将血红颤菌蛋白编码基因vhB整合至大肠杆菌的yjiV位点，用同一个Ptrc启动子控制转录；

(13)为了加强脯氨酸向细胞外转运，将脯氨酸转运蛋白编码基因cgl2622整合至大肠杆菌的yjgX位点，用同一个Ptrc启动子控制转录。

4.权利要求1所述基因工程菌在生产反式-4-羟基脯氨酸方面的应用。