[发明专利]一种重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇高效制备冷杉醇的方法

说明书

冷杉醇降解产生龙涎香香气物质，可改善烟草香味品质，广泛应用于香料工业。本发明开发了一种低成本、高效的静息细胞催化制备冷杉醇新方法。通过敲除去磷酸化酶编码基因phoA、ybjG、pgpB及外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ，组成型过表达脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR和甘油代谢操纵子基因glpFK，过表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ‑异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当‑13‑烯‑8‑醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶获得重组大肠杆菌。采用静息细胞催化工艺可于24h催化3.0g/L异戊烯醇生成1.80g/L冷杉醇，转化率达71.15％，远高于目前文献及专利报道水平。静息细胞可重复使用5‑6次，操作简单、经济性好，相比发酵法有更佳的规模制备冷杉醇潜力。

技术领域

本发明涉及一种重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇高效制备冷杉醇的方法，属于生物工程领域。

背景技术

萜类物质是普遍存在的植物次生代谢物，也是烟草最重要的一类致香组分。尤其是烟草中二萜烯醇类化合物——主要包括西柏烯醇类与赖百当醇类化合物，对于烟草的香气品质具有重要影响；其含量差异与不同类型烟草的品质特征具有显著相关性，且其降解产物均是代表性的烟草香味物质。在香料烟中，赖百当类是常见二萜烯醇化合物，其中顺-冷杉醇是大部分香料烟和部分雪茄烟中特有的香气前体物，对烟草香气特征具有重要作用，其降解产生强烈龙涎香香气的物质，对增加卷烟香气和吸味非常有效，与烟草的特征香韵谐调和合，并可掩盖杂气，即使微量使用，也可改善烟草的香味品质，尤其适合混合型卷烟加香，常用于卷烟浸膏。顺-冷杉醇作为琥珀样龙涎香的半合成前体物，因其优美的香气、良好的定香效果及对烟气质量的影响，被广泛应用于香料工业。目前烟草特征香味前体物质冷杉醇多采用提取法，以富含冷杉醇烟叶中提取而来，而冷杉醇在烟叶中含量较低，同时受制于烟草原料的获得，成为制约提取法大规模应用的瓶颈。近年来，随着合成生物学迅速发展，微生物发酵法成为冷杉醇合成研究热点，前已有文献及专利报道以葡萄糖或甘油为底物通过微生物发酵法生物合成冷杉醇。但受制于底物甘油或葡萄糖做为底物同时参与细胞多个反应，尽管强化了冷杉醇异源合成途径和前体物供给，但合成效率依然较低。Li等通过强化冷杉醇异源合成途径和前体物供给，在1.3L发酵罐中发酵培养工程菌株约100h，冷杉醇产量～634.7mg/L(Li.etal.(2019).Combinatorial Engineering of MevalonatePathway and Diterpenoid Synthases in Escherichia coli for cis-AbienolProduction.Journal of Agricultural and Food Chemistry,67(23),6523-6531.)。Cheng等同样通过强化前体物供给获得了工程菌株，发酵培养52h冷杉醇产量～220mg/L，产量较低(Cheng.et al.(2020).Improved cis-Abienol production through increasingprecursor supply in Escherichia coli.Scientific Reports,10(1),16791)。Zhang等以异戊烯醇为底物生物发酵合成冷杉醇，在1.3L发酵罐中进行发酵约144h，转化底物6.8g/L异戊烯醇合成1375.7mg/L冷杉醇，产量大幅提升，但整体发酵时间过长，且底物转化率仅为24.1％(Zhang.et al.(2022).Engineering Escherichia coli for effective andeconomic production of cis-abienol by optimizing isopentenol utilizationpathway.Journal of Cleaner Production,351)。因此目前微生物发酵法合成冷杉醇产率仍较低，合成水平不够理想。由于发酵过程采用有机相对发酵体系进行萃取，其萃取产物会掺杂除冷杉醇外大量来自于发酵液中脂溶性物质(如培养基中脂溶性成分、脂溶性细胞内含物、脂溶性细胞代谢产物等)，这对后续分离纯化及应用带来困难。因此，亟待开发一种产率高、成本低且具有高效率的冷杉醇合成方法。