[发明专利]一种重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇高效制备冷杉醇的方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌静息细胞的制备方法，其特征在于，敲除大肠杆菌宿主中磷酸酶编码基因phoA、ybjG、pgpB及外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ，脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR的组成型过表达，甘油代谢操纵子基因glpFK的组成型过表达，构建大肠杆菌工程菌株LSC-06；在所述大肠杆菌工程菌株LSC-06的基础上构建共表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶的大肠杆菌工程菌株LSC-07；对大肠杆菌工程菌株LSC-07进行培养获得重组大肠杆菌静息细胞。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株LSC-06的构建方法为：

(1)碱性磷酸酶编码基因phoA的敲除：

以Escherichia coli C41(DE3)基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除phoA基因的大肠杆菌工程菌株LSC-01；

(2)十一异戊酸二磷酸酶编码基因ybjG的敲除：

以大肠杆菌工程菌株LSC-01基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除ybjG基因的大肠杆菌工程菌株LSC-02；

(3)磷脂酰甘油磷酸酯酶编码基因pgpB的敲除；

以大肠杆菌工程菌株LSC-02基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除pgpB基因的大肠杆菌工程菌株LSC-03；

(4)外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ的敲除

以大肠杆菌工程菌株LSC-03基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除nlpⅠ基因的大肠杆菌工程菌株LSC-04；

(5)脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR的组成型过表达

以大肠杆菌工程菌株LSC-04基因组为模板，设计供体DNA，构建置换脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR启动子为组成型强启动子P_tac的大肠杆菌工程菌株LSC-05；

(6)甘油代谢操纵子glpFK的组成型过表达

以大肠杆菌工程菌株LSC-05基因组为模板，设计供体DNA，构建甘油激酶编码基因glpFK启动子为组成型强启动子P_tac的大肠杆菌工程菌株LSC-06。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株LSC-07的构建方法为：

(1)构建含有羟乙基噻唑激酶编码基因EcThiM和异戊烯基磷酸激酶MthIPK的重组表达载体pCTI；

(2)构建含有双功能二磷酸法呢基合酶编码基因ScERG20、异戊烯基二磷酸δ-异构酶编码基因ScIDI和香叶基香叶基二磷酸合酶编码基因TcGGPPS的重组表达载体pAEIG；

(3)构建含有赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶编码基因CcCLS和冷杉醇合酶编码基因NtABS的重组表达载体pRCA；

(4)通过质粒共转化的方式，将步骤(1)-(3)中构建的重组表达载体pCTI、pAEIG、pRCA，共同转入要求1所述的大肠杆菌工程菌株LSC-06，构建同时表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶的大肠杆菌工程菌株LSC-07。

4.一种利用权利要求1-3任一项的制备方法得到的重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇制备冷杉醇的方法。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在100mL催化反应体系中，分别加入终浓度为1.0-5.0g/L的异戊烯醇、20-200g/L的重组大肠杆菌静息细胞、0-40g/L甘油，添加20mM pH7.0PB缓冲液至体积为100mL，最后添加占反应体系总体积10-20％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯；25℃催化反应12-24h，合成冷杉醇。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在100mL催化反应体系中添加终浓度为10-40g/L的甘油。