[发明专利]利用花粉粒的流式细胞术检测马铃薯染色体倍性的方法

说明书

本发明公开了一种利用花粉粒的流式细胞术检测马铃薯染色体倍性的方法，所述方法包括：取现蕾未开花粉，并进行干燥处理，得到花粉样品；向所述花粉样品中加入裂解液，得到花粉裂解液；将所述花粉裂解液依次进行过滤和离心处理，得到离心沉淀物；向所述离心沉淀物中依次加入预冷的裂解液和PI染料后，过滤至流式细胞仪中进行检测。本发明的方法有效规避了应用叶片鉴定倍性时存在的病原微生物、害虫残留的DNA干扰、冻融过程中DNA易降解等问题，所检测倍性的结果准确度更高。

技术领域

本发明涉及染色体倍性检测技术领域，尤其涉及一种利用花粉粒的流式细胞术检测马铃薯染色体倍性的方法。

背景技术

流式细胞仪(Flow cytometer)是一种可对细胞或微粒进行自动分析和分选的仪器，因其能够快速准确地检测DNA含量并对细胞周期进行分析，常被用于染色体倍性鉴定。其染色体倍性检测原理：利用特殊的荧光染料(PI、EB、DAPI等)与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光。同时，荧光强度与DNA含量成正比，通过测定细胞的荧光强度可以推算出细胞的DNA含量。由于染色体倍性和细胞DNA的含量相关联，细胞有丝分裂复制前期(G1期)DNA含量间接反映该细胞的倍性水平。因此，以已知染色体数目及倍性的标准样品作为对照，采用流式细胞仪可以快速准确地检测同一物种不同倍性的样品。

花粉是被子植物产生雄配子并运载雄配子进入雌蕊胚囊中的载体，是显花植物繁殖器官雄蕊的重要组成部分。花粉是由花粉母细胞经减数分裂形成的，其细胞内的染色体数量是正常体细胞的一半。

利用流式细胞仪鉴定植物倍性时，常采用叶片进行样品制备。但是，叶片易受各种病原微生物和害虫侵害，导致叶片中易掺杂病原微生物和害虫的DNA。此外，在制备样品过程中叶片的DNA易降解，这就使得精准鉴定植物染色体倍性的难度大大增加。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用花粉粒的流式细胞术检测马铃薯染色体倍性的方法，有效规避了应用叶片鉴定倍性时存在的病原微生物、害虫残留的DNA干扰、冻融过程中DNA易降解等问题，所检测倍性的结果准确度更高。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种利用花粉粒的流式细胞术检测马铃薯染色体倍性的方法，所述方法包括如下步骤：

取现蕾未开花粉，并进行干燥处理，得到花粉样品；

向所述花粉样品中加入裂解液，得到花粉裂解液；

将所述花粉裂解液依次进行过滤和离心处理，得到离心沉淀物；

向所述离心沉淀物中依次加入预冷的裂解液和PI染料后，过滤至流式细胞仪中进行检测。

进一步地，所述的向所述花粉样品中加入裂解液，得到花粉裂解液具体包括：

向装有花粉样品的干燥离心管内加入预冷的裂解液1mL和三颗3mm小钢珠，于磨样机中研磨，冰上静置，使细胞充分裂解，得到花粉裂解液。

进一步地，所述研磨的条件包括：

频率：50-55hz，时间：30-60s，温度：4℃。

进一步地，所述裂解液的制备方法具体为：

向ddH₂O中依次加入MgCl₂、Na₃C₆H₅O₇·2H₂O、Mops和Triton X-100，混合均匀即得到裂解液。

进一步地，所述MgCl₂的浓度为45mM/L。