[发明专利]荧光定量PCR检测BCC的引物探针及其设计方法和试剂盒

权利要求书

1.一种荧光定量PCR检测BCC的引物探针设计方法，其特征在于，

1）准备用于筛选BCC物种特异性DNA片段的基因组作为阳性集合，包含871个基因组，覆盖全部23个BCC物种；非BCC物种基因组作为阴性集合，包含19183个基因组，覆盖物种数量为13708，属数量为3092个；

2）基于BCC阳性集合基因组，采用RUCS软件筛选核心保守序列，再针对核心保守序列设计扩增引物，参数设定为：产物长度120-200 bp，k-mer设置为20；

3）核心保守序列和扩增引物的验证

采用软件mfeprimer v3.2.4进行引物验证，验证数据库包括1127个阳性基因组，含全部23个BCC物种，以及61927个阴性基因组，含11481个物种，覆盖2807个属；

4）Taqman探针设计，模拟提取所有BCC基因组中对应的扩增产物，设置kmer为15-35bp，统计出与所有阳性扩增产物错配个数为0，阴性扩增产物错配个数 = 1的kmer作为探针序列，从而获得探针序列；

5）扩增引物和探针的评价，利用Wilson方法统计引物、引物+探针、引物+探针+长度过滤的特异性、灵敏性指标。

2.根据权利要求1所述的引物探针设计方法，其特征在于，步骤2）中获得核心保守序列如SEQ ID No.1所示；

根据核心保守序列得到

正向扩增引物序列为：CAAGGTCGAGGAAGGCAAGAA，如SEQ ID No.2所示；

反向扩增引物序列为：CCGGGCACAACCTTTTCTTTG，如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求1所述的引物探针设计方法，其特征在于，步骤4）中获得的探针序列为：TACTGAGCGCCTGACGCAG，如SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求1所述的引物探针设计方法，其特征在于，步骤5）中根据in-silico验证，灵敏度达到99.82，CI 99.36-99.95，特异性达到100.00，CI 99.99-100.00。

5.一种荧光定量PCR检测BCC的引物探针, 其特征在于，

正向扩增引物序列为：CAAGGTCGAGGAAGGCAAGAA，如SEQ ID No.2所示；

反向扩增引物序列为：CCGGGCACAACCTTTTCTTTG；如SEQ ID No.3所示；

荧光探针序列为：TACTGAGCGCCTGACGCAG，如SEQ ID No.4所示。

6.一种基于荧光定量PCR技术检测BCC的试剂盒，其特征在于，采用根据权利要求6所述的引物和荧光探针组合，其中，正向扩增引物序列为：CAAGGTCGAGGAAGGCAAGAA，如SEQ IDNo.2所示；

反向扩增引物序列为：CCGGGCACAACCTTTTCTTTG，如SEQ ID No.3所示；

荧光探针序列为：TACTGAGCGCCTGACGCAG，如SEQ ID No.4所示；荧光探针的5端标记有荧光基团，3端标记有淬灭基团。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，设有对照探针，5端标记有荧光基团VIC，3端淬灭基团BHQ1；序列为CTTGCTCGCGTAATTAATGACAAGACGC，如SEQ ID No.5所示。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，设有PCR缓冲液，Taq酶，dNTPs，Mg²⁺溶液。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，设有标准阳性模板、阴性模板和对照扩增模板，阳性模板为构建的标准品阳性质粒，阴性模板为灭菌双蒸水，对照扩增模板序列如SEQ ID No.6所示。