[发明专利]一种多重qPCR检测细菌的探针引物组、试剂盒以及检测方法

权利要求书

1.一种多重qPCR检测细菌的探针引物组，其特征在于，用于单反应同时检测鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌的四重荧光PCR反应，包括：

用于对鲍曼不动杆菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；

用于对肺炎克雷伯菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；

用于对嗜麦芽窄食单胞菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示；

用于对铜绿假单胞菌检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示。

2.根据权利要求1所述的多重qPCR检测细菌的探针引物组，其特征在于，所述的探针引物组中还包括分别对扩增产物进行报告的探针组合；所述的探针组合包括：

用于对鲍曼不动杆菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

用于对肺炎克雷伯菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

用于对嗜麦芽窄食单胞菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

用于对铜绿假单胞菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1所述的多重qPCR检测细菌的探针引物组，其特征在于，所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX、ROX和Cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。

4.根据权利要求3所述的多重qPCR检测细菌的探针引物组，其特征在于，所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述猝灭基团为BHQ1和BHQ2；SEQ ID NO.3所示核苷酸序列与SEQ IDNO.6所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ1修饰，SEQ ID NO.15所示核苷酸序列与SEQ IDNO.12所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ2修饰。

5.一种多重定量PCR检测细菌的方法，其特征在于，其采用上述的探针引物组进行多重定量PCR反应对鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌进行鉴定。

6.根据权利要求5所述的多重定量PCR检测细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)从样品中提取核酸；2)以提取的核酸为模板，用探针引物组进行多重荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；3)根据荧光信号判定样品中是否含有鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌。

7.根据权利要求6所述的多重定量PCR检测细菌的方法，其特征在于，所述的样本包括但不限于肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液、心包积液、胸水、尿液、脓液、拭子和组织等。

8.根据权利要求5所述的多重定量PCR检测细菌的方法，其特征在于，上述步骤2)中的多重荧光定量PCR扩增反应体系为：

多重荧光qPCR扩增反应程序为:95℃预变性5min；95℃变性15s，58.5℃退火30s，共45个循环。

9.一种试剂盒，其特征在于，其中包含有权利要求1或2所述的探针引物组。

10.权利要求1或2所述的探针引物组在制备四重荧光PCR反应检测鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌的试剂盒中的用途。