[发明专利]一种重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)-柠苹酸的方法

说明书

本发明公开了一种重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)‑柠苹酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明在地衣芽孢杆菌中异源表达柠苹酸合酶，搭建了(R)‑柠苹酸合成途径，以葡萄糖为底物，建立及优化了重组菌株进行全细胞转化产(R)‑柠苹酸的条件，实现了(R)‑柠苹酸的合成与积累，转化120h可生成(R)‑柠苹酸8.57g/L，转化率为142.84mg/g葡萄糖，具有制备简单、生产成本低、抗环境压力能力强、副产物少和产率高等优点。

技术领域

本发明涉及一种重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)-柠苹酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

(R)-柠苹酸(R-citramalate)是一种五碳羟基二羧酸，广泛存在于某些细菌的代谢途径当中，例如，詹式甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens)、黄杆菌(Chlorobaculum tepidum)中异亮氨酸的生物合成途径；破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)中谷氨酸的厌氧代谢等，均涉及(R)-柠苹酸的合成。(R)-柠苹酸是重要的多功能有机酸，其作为聚合物中间体甲基丙烯酸(MAA)的化学合成前体，不仅可以用于树脂生产工业，而且可以作为酸化剂、除皱剂在食品加工、美容、医疗等领域发挥着重要作用。因此，(R)-柠苹酸具有广阔的应用和市场前景。

柠苹酸的合成方法主要为化学法，以氰化氢和乙基乙酰酯为底物通过缩合反应合成。但是，由于前体物质的毒性及其所带来的高成本等问题，难以满足可持续发展的需求，极大限制了该方法的应用。近些年来，随着合成生物学的发展，柠苹酸的生物合成已经成为了更具吸引力的替代方案：以丙酮酸和乙酰-CoA为前体物质，在柠苹酸合酶的催化下特异性缩合形成柠苹酸。

2018年，Wu Xianghao等在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达柠苹酸合酶——CimA3.7(该酶来源于詹式甲烷球菌，是由ATSUMI等人经过筛选和定向进化后得到的稳定性更高的酶)，由此成功引入柠苹酸合成途径，得到高产柠苹酸的重组大肠杆菌菌株。该研究以葡萄糖为底物，最终在摇瓶发酵水平产生2.9g/L柠苹酸。虽然大肠杆菌遗传操作简单，但在工业化发酵过程中，其噬菌体侵染的问题仍缺乏有效的解决策略；再者，对于利用重组大肠杆菌生产柠苹酸的过程，由于大肠杆菌对底物葡萄糖的耐受性以及产物积累造成环境pH值降低而导致细胞生长代谢受损的现象，不利于高浓度柠苹酸的积累。

目前，有关柠苹酸生物生产的研究主要集中于传统发酵法，尚未提出利用全细胞转化这一生产工艺进行产物合成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)-柠苹酸的方法，旨在解决现有技术中传统发酵法合成柠苹酸转化率不高、资源浪费等技术问题。

为达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明提供了一种可转化生产(R)-柠苹酸的重组地衣芽孢杆菌，以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CICIM B1391为宿主；所述柠苹酸合酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在一种实施方式中，所述CICIM B1391公开于论文《地衣芽孢杆菌强组成型启动子的鉴定及其表达效果验证》中，申请人承诺自申请日起20年内通过合法途径向公众发放该菌株。

在一种实施方式中，所述柠苹酸合酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，以质粒pHY-PLK300为表达载体。

本发明还提供了含有所述地衣芽孢杆菌的细胞催化剂。

在一种实施方式中，所述细胞催化剂的制备方法为：将所述重组地衣芽孢杆菌在培养基中培养一段时间，收集菌体作为全细胞催化剂。