[发明专利]基于rpoB基因对贝类内生单胞菌进行定量的方法及其应用

说明书

本发明属于微生物学、分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种基于rpoB基因对贝类内生单胞菌进行定量的方法及其应用。具体为：以贝类内生单胞菌中rpoB基因的高突变区域设计特异性引物；基于此特异引物通过荧光实时定量PCR(RT‑PCR)对内生单胞菌在贝类体内的的分布和丰度实现定量检测。发明中的定量方法，在文蛤养殖监测中具有应用前景，同时对其他共生菌的绝对定量方法开发具有借鉴意义。

技术领域

本发明属于微生物学、分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种基于rpoB基因对贝类内生单胞菌进行定量的方法及其应用。

背景技术

贝类是我国海水养殖业的支柱之一。近些年，贝类夏季死亡频繁发生，造成严重的经济损失。目前，还没有有效的贝类夏季死亡的监测预警指标。近期一些研究指出，贝类体内微生物的组成变化与疾病密切相关。文蛤是一种重要的滩涂经济贝类。发明人通过前期研究发现，文蛤体内的内生单胞菌(Endozoicomonas)丰度与其健康状况显著相关。内生单胞菌广泛存在于海洋无脊椎动物的体内。已有研究也指出，内生单胞菌的丰度下降往往预示着疾病的发生。例如，珊瑚中已经广泛报道了其内生单胞菌的丰度与珊瑚白化病的发生显著相关。

然而，目前还没有建立准确定量贝类体内内生单胞菌的方法。根据已有报道，荧光定量PCR(RT-PCR)已被用于其他菌的定量中，菌特异的16SrRNA是常用的检测目标基因，但16S rRNA并不是单拷贝基因，会影响定量的准确性。另外，相对于菌的相对定量，目前关于构建菌绝对定量方法的报道较少。RNA聚合酶β亚基编码基因(rpoB基因)是一个广泛存在于各种微生物基因组中的基因，且已成为系统发育分析和细菌鉴定的核心候选基因。rpoB基因具有高度的物种特异性，其序列的变异区段，能有效区分近缘物种。另外，rpoB是单拷贝基因，相比于16S rRNA基因具有定量更为准确的优势。因此，本发明选择rpoB进行文蛤内生单胞菌的绝对定量分析。

发明内容

本发明的目的在于一种基于rpoB基因对贝类内生单胞菌进行定量的方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于rpoB基因对贝类内生单胞菌进行定量的方法，

(1)以贝类内生单胞菌中rpoB基因的高突变区域设计特异性引物；

(2)基于此特异引物通过荧光实时定量PCR(RT-PCR)对内生单胞菌在贝类体内的的分布和丰度实现定量检测。

所述贝类为文蛤；其，特异性引物为

rpoB-F:5’CAAAGACTCCGCAAACAA 3’；

rpoB-R:5’AGCCACGGTAAGGAATAAC 3’。

提取待检测文蛤组织的DNA，利用内生单胞菌特异性引物对待检测DNA进行RT-PCR，建立内生单胞菌DNA含量与rpoB基因Ct值的关系方程，通过该关系方程即可实现定量检测内生单胞菌，并对其在文蛤体内的分布和丰度实现定量检测。

所述建立内生单胞菌含量(CFU)与rpoB基因Ct值的关系方程为其中x1为Ct值，x2为定量PCR体系中DNA模板的量(μl)，y为内生单胞菌含量(CFU)；

具体换算过程包括：

1)通过分别确定600nm下不同浓度内生单胞菌液吸光值(OD600)与菌数量、OD600与内生单胞菌DNA量的对应关系，获得内生单胞菌数量(CFU)与菌DNA量的换算方程；

2)建立rpoB的Ct值与内生单胞菌DNA量的标准曲线及其特征方程；

3)基于1)和2)，最终换算确定rpoB基因Ct值与内生单胞菌数量(CFU)的对应关系。