[发明专利]基于rpoB基因对贝类内生单胞菌进行定量的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于rpoB基因对贝类内生单胞菌进行定量的方法，其特征在于：

(1)以贝类内生单胞菌中rpoB基因的高突变区域设计特异性引物；

(2)基于此特异引物通过荧光实时定量PCR(RT-PCR)对内生单胞菌在贝类体内的的分布和丰度实现定量检测。

2.按权利要求1所述的基于rpoB基因对贝类内生单胞菌进行定量的方法，其特征在于：所述贝类为文蛤，其，特异性引物为

rpoB-F:5’CAAAGACTCCGCAAACAA 3’；

rpoB-R:5’AGCCACGGTAAGGAATAAC 3’。

3.按权利要求1或2所述的基于rpoB基因对贝类内生单胞菌进行定量的方法，其特征在于：提取待检测文蛤组织的DNA，利用内生单胞菌特异性引物对待检测DNA进行RT-PCR，建立内生单胞菌DNA含量与rpoB基因Ct值的关系方程，通过该关系方程即可实现定量检测内生单胞菌，并对其在文蛤体内的分布和丰度实现定量检测。

4.按权利要求3所述的基于rpoB基因对内生单胞菌进行定量的方法，其特征在于：所述建立内生单胞菌含量(CFU)与rpoB基因Ct值的关系方程为其中x1为Ct值，x2为定量PCR体系中DNA模板的量(μl)，y为Mp-endo含量(CFU)；

具体换算过程包括：

1)通过分别确定600nm下不同浓度内生单胞菌液吸光值(OD600)与菌数量、OD600与内生单胞菌DNA量的对应关系，获得内生单胞菌数量(CFU)与菌DNA量的换算方程；

2)建立rpoB的Ct值与内生单胞菌DNA量的标准曲线及其特征方程；

3)基于1)和2)，最终换算确定rpoB基因Ct值与内生单胞菌数量(CFU)的对应关系。

5.按权利要求3所述的基于rpoB基因对内生单胞菌进行定量的方法，其特征在于：所述待检测样品中内生单胞菌浓度低(Ct30)时，在RT-PCR定量菌含量前，利用普通PCR对待检测文蛤组织的DNA中rpoB基因进行预富集，进而实现对低含量内生单胞菌分布和丰度的定量检测。

6.按权利要求5所述的基于rpoB基因对内生单胞菌进行定量(预扩增)的方法，其特征在于：所述普通PCR中引物为

rpoB-F:5’CAAAGACTCCGCAAACAA 3’；

rpoB-R:5’AGCCACGGTAAGGAATAAC 3’；

PCR的预扩增循环数为8-10。

7.按权利要求5所述的基于rpoB基因对内生单胞菌进行定量的方法，其特征在于：所述Mp-endo菌DNA含量与rpoB基因Ct值的关系方程为其中x1为Ct值(30)，x2为定量PCR体系中DNA模板的量(μl)，x3为普通PCR预扩增循环数，y为内生单胞菌含量(CFU)。

8.一种权利要求1所述方法的应用，其特征在于：所述方法用于检测内生单胞菌在文蛤体内的分布和丰度变化，进而在文蛤养殖过程检测个体健康状况中的应用。