[发明专利]一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法

说明书

本发明公开了一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法，包括：合成硫酯片段I、片段II或合成硫酯片段III、片段IV；硫酯片段I与片段II或硫酯片段III与片段IV在水相中进行自然片段连接反应，得到普卡那肽线性粗肽M1或M2；普卡那肽线性粗肽M1或M2的半胱氨酸氨基酸残基经两步氧化环化，得到普卡那肽粗肽，经过分离纯化获得普卡那肽纯品。本发明通过自然化学连接法提高了普卡那肽线性肽的纯度，减少在氧化过程中产生的副产物，提高了氧化过程的收率。同时，由于所用多肽片段是裸露的，可预先纯化，大大减少最终产品的杂质，在最终纯化步骤中，杂质不是缺少一个或几个氨基酸的缺损肽，而是未连接的部分片段，减轻纯化难度。

技术领域

本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法。

背景技术

普卡那肽(plecanatide)由美国Synergy制药公司研发，用于治疗慢性特发性便秘(CIC)及便秘型肠易激综合征(IBS-C)2种常见的胃肠道疾病的药物。美国食品药品管理局(FDA)于2017年1月19日批准上市，商品名为Trulance。普卡那肽是尿鸟苷蛋白(uroguanylin)的类似物，含有16个氨基酸的环状多肽，其序列为：H-Asn-Asp-Glu-Cys⁴-Glu-Leu-Cys⁷-Val-Asn-Val-Ala-Cys¹²-Thr-Gly-Cys¹⁵-Leu-OH(两对二硫键：Cys⁴-Cys¹²和Cys⁷-Cys¹⁵)，其结构式如下：

目前普卡那肽的合成方法主要采用固相逐步偶联法(Fmoc-SPPS)，虽然Fmoc/tBu固相逐步合成具有操作简单，自动化程度高等优点。但采用常规的保护氨基酸进行固相逐步偶联进行合成时发现由于分子间氢键的作用易于聚集，形成如β折叠片等二级结构，导致从Asn⁹树脂开始收缩，后续氨基酸偶联愈加困难，导致线性主链粗肽的纯度较差、收率低、工业化生产成本高。此外，普卡那肽的合成也可以使用全保护片段通过液相法合成，如：专利US10011637和CN201280021221.6，但是该方法需要提前制备2个以上的片段，且片段之间液相缩合后处理繁琐，工业化生产步骤多，成本高。

发明内容

为了解决现有技术中的不足：无论是固相逐步偶联法还是全保护片段液相法合成普卡那肽，普卡那肽线性肽的粗肽纯度往往都不高，导致在后续氧化过程中产生大量的错配等副产物，本发明旨在提供一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法。

具体技术方案如下：

本发明提供一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法，包括如下步骤：

(1)合成硫酯片段I、片段II或者合成硫酯片段III、片段IV；

所述硫酯片段I为H-Asn-Asp-Glu-Cys⁴-Glu-Leu-Cys(Acm)⁷-Val-Asn-Val-Ala-SR；

所述片段II为Cys¹²-Thr-Gly-Cys(Acm)¹⁵-Leu-OH；

所述合成硫酯片段III为H-Asn-Asp-Glu-Cys(Acm)⁴-Glu-Leu-SR；

所述片段IV为Cys⁷-Val-Asn-Val-Ala-Cys(Acm)¹²-Thr-Gly-Cys¹⁵-Leu-OH；

其中，所述SR为硫醇的残基；

(2)硫酯片段I与片段II或者硫酯片段III与片段IV在水相中进行自然片段连接反应，得到普卡那肽线性粗肽M1或者M2；