[发明专利]一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法

权利要求书

1.一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将蛋白质消化酶至投入离心管中，再依次将细胞裂解液和血液样品送入离心管中，把离心管送入离心机中，在3000rpm下高速涡旋震荡20-30s，结束后将离心管水浴孵育处理20min，水浴孵育结束后，向离心管中加无水乙醇并送入离心机内，在3000rpm下高速涡旋震荡40-50s，再将离心机转速提高到10000g并离心5秒，接着将离心管内的混合液转移到硅胶膜柱子中，并把硅胶膜柱子放入新的离心管内，对装有硅胶膜柱子的新离心管进行离心处理，将离心处理后的硅胶膜离心柱取出并置于无核酸酶的离心管中，对其进行分离处理，得到DNA提取液，并将DNA提取液放置在-20℃保存；

S2，将DAN提取液送入试管内，然后加入缓冲液和海藻糖，搅拌混合均匀后，在-5℃静置10-20min，然后加入含有海藻糖的扩增反应试剂和DNA聚合酶，在43-45℃下保温反应20-30min，再加热至55℃终止反应，得到DNA扩增产物；

S3，以dTTP、dGTP、dATP以及第三标记物作为底物，将DNA扩增产物组加入到固定有亲和素受体的酶标板中，使DNA扩增产物通过第三标记物与亲和素受体的作用固定到酶标板上，使用第一荧光标记物标记目标基因引物组的上游引物，用第二荧光标记物标记目标基因引物组的下游引物，用酶标仪检测DNA扩增产物中是否存在第一荧光标记物和第二荧光标记物。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述S1中水浴孵育处理的具体操作步骤为：将混合液离心管放入水浴锅中，在65℃下水浴孵育10min，取出离心管并送入离心机中，在3000rpm下涡旋震荡5秒，再放回水浴锅继续孵育10min，取出离心管并送入离心机内，在10000g下离心2秒。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述S1中离心处理的具体操作步骤为：将装有硅胶膜柱子的离心管放入离心机中并在10000g下离心1min，离心结束后，将硅胶膜柱子从离心管中取出并放入新的离心管中，用洗涤液冲洗后，送入离心机内在10000g下离心1分钟后取出并弃液，再加入漂洗液，并再次送入离心机内在10000g下离心1分钟后取出并弃液，重复上述操作2-3次。

4.根据权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述S1中分离处理的具体操作步骤为：向无核酸酶的离心管中加入DNA洗脱液，室温静置5分钟后，送入离心机内，在13000g下离心1分钟，分离并保留离心液，将离心液加入硅胶膜离心柱中，室温静置5分钟后，再次送入离心机内，在13000g转离心1分钟，留液弃柱。

5.根据权利要求3所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述洗涤液由蛋白质洗涤原液与异丙醇按照体积比8∶3的比例混合制成，洗涤液与血液样品的体积比为2∶1，漂洗液由漂洗原液与无水乙醇按照体积比1∶4的比例混合制成，漂洗液与血液样品的体积比为14∶5。

6.根据权利要求4所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述DNA洗脱液使用前要预热至65℃，DNA洗脱液与血液样品的体积比为4∶5。

7.根据权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述S2中含有海藻糖的扩增反应试剂由10-50mmol/L的Tris-HCl(pH值为7.5)、5-50mmol/L的NaCl、2-20mmol/L的MgCl ₂、2-50mmol/L的(NH4)₂SO₄、1-10mmol/L的DTT、10-00ng/μl的BSA以及0.1-1.0M的海藻糖混合后并进行10倍稀释得到，DNA聚合酶为phi 29DNA聚合酶，DNA扩增产物包括突变基因引物组、突变基因引物组的上游引物以及突变基因引物组的下游引物。