[发明专利]一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体

说明书

本发明提供了一种能够成功在马克斯克鲁维酵母菌株中复制和表达外源基因的载体，含有顺序连接的如下片段：NC1启动子、CYC终止子、复制子、抗性基因、营养基因A，且营养基因A和NC1启动子之间连接有SEQ ID NO.8所示序列；其中，复制子、抗性基因、营养基因A反向连接。本发明还提供了上述载体与氧化酶A基因构成的重组载体，含有该重组载体的马克斯克鲁维酵母重组菌可以稳定、高效地生产具有氧化功能的蛋白酶，具有工业化推广应用的价值。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体。

背景技术

随着基因工程技术、分子生物学技术的不断发展，目前，已出现了多种用于表达外源基因的蛋白表达系统，目前常用的包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。原核表达技术以大肠杆菌表达系统为代表，具备遗传背景清楚、成本低、表达量高、产物分离纯化简单等优势，目前已十分成熟。因此，利用真核表达系统来表达蛋白越来越受到研究人员的重视。

昆虫、哺乳动物细胞表达系统的基因产物真实性好，但操作困难、产率低、成本高，不适于大规模生产；因此，以酵母表达系统为主的真核表达系统逐渐成为基础研究和工业生产的重要工具。

目前，常用的酵母表达系统以瞬时表达系统——酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和稳定表达系统——毕赤酵母(Pichia pastoris)为典型代表。酿酒酵母生长密度低，不易于大规模发酵，分泌30kDa以上分子量的能力弱，生长周期长。毕赤酵母需要利用甲醇进行诱导表达，发酵过程存在危险因素，生长周期长。因此，发展生长周期短、蛋白表达量高和安全性高的酵母表达系统具有潜在工业价值。

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)属于酵母科克鲁维属，是一种食品安全级酵母，具有生长快、耐高温等多种生理生化特点，目前利用基因工程技术，已经实现了数种外源蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达，例如α-半乳糖苷酶、乳糖脱氢酶、耐热纤维素酶等(郭超,陈勇毅,周峻岗,等.一种针对马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)的无痕基因组改造方法[J].复旦学报(自然科学版),2016,55(5):576-586.)，在外源蛋白的表达中表现出很好的潜力。

氧化酶对化工、医药重要化合物的绿色合成具有重要意义，目前，尚未有报道表明马克斯克鲁维酵母能表达出具有活性的氧化酶。因此，开发基于马克斯克鲁维酵母系统，用于表达有活性的氧化酶具有潜在的价值。

对于马克斯克鲁维酵母这种新型的表达系统而言，目前对其生理特性、遗传特性的研究程度还有限，能够用于外源基因表达的重组载体的报道也较少；且现有报道的在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体均设计类型和种类均有限，例如专利申请CN105063082A、CN105063081A、CN105132452A、CN105063080A等公开的重组载体，均基于pKD1片段设计。

因此，研发新型的，能够在马克斯克鲁维酵母菌株中高效表达氧化酶的重组载体，值得进一步探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体。

本发明提供了一种载体，含有顺序连接的如下片段：NC1启动子、CYC终止子、复制子、抗性基因、营养基因A；

所述NC1启动子的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述CYC终止子的序列如SEQ ID NO.4所示；

所述营养基因A的序列如SEQ ID NO.5所示；

所述复制子的序列如SEQ ID NO.7所示；

营养基因A和NC1启动子之间连接有SEQ ID NO.8所示序列；