[发明专利]一种具有类分子伴侣功能的固定化载体及应用

说明书

本发明公开了一种具有类分子伴侣功能的柔性智能固定化载体及应用。本发明基于高通量筛选方法得到的柔性聚合物固定化载体对酶蛋白具有较高的亲和力和良好的选择性，可以代替传统的固定化载体；该固定化载体是由化学方法制备的柔性聚合物，具有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境的能力，克服了传统固定化酶载体对酶蛋白选择性差、制备成本高、酶的催化活性降低等缺点。本发明制备的固定化载体为柔性聚合物，有利于适配酶的柔性构象，能够发挥分子伴侣功能，与变性失活的酶结合，利用柔性聚合物的特异性分子印迹空穴，无需外加条件和复杂的实验设备，能够恢复酶的结构和催化性能，实现变性酶的复性。

技术领域

本发明属于酶的固定化技术领域，特别涉及一种具有类分子伴侣功能的柔性智能固定化载体及应用。

背景技术

酶对生命至关重要，承担着催化几乎所有新陈代谢过程的重要任务。酶是绿色生物制造的“芯片”，由于具有高选择性、高专一性和温和性等优点，在工业生物合成中极具价值。酶的高活性和稳定性是酶催化的普遍要求。但是酶在工程化应用中的主要缺点是在复杂应用环境下的稳定性差、易失活，例如温度和pH的改变、有机溶剂、小分子抑制剂、甚至其他蛋白质的存在会对酶的活性和稳定性产生影响。为了提高酶的性能，目前发展的解决方法包括酶的分子改造和酶的固定化，分别对酶分子本身和酶分子的环境进行改造。但酶活性与稳定性存在trade-off效应，如何同时提高酶在复杂应用环境下的稳定性和活性仍是目前的研究难点。

常规的固定化酶载体大多为刚性，为酶提供的弛豫时间短，微环境与酶分子之间是非特异性相互作用，虽然可以提高酶的稳定性，但酶表观活性一般会有至少30-50％的损失，在实际应用中存在很大的局限性。正如陈超、汤文等人在专利(公开号CN110343693A)中公开的一种磁性固定化酶载体的制备方法，这种共价固定化方法能够最大限度的提高固定化酶的稳定性，但是将酶固定在载体后只保留了69.2％的脂肪酶活性。

酶蛋白在应用过程中往往伴随着二级结构的变化，当酶的二级结构变化后酶的活性遭到剧烈的破坏，为了让酶的二级结构得到恢复，人们已经设计出了一些恢复酶活性的方法，但是这些方法往往过程复杂，外加条件苛刻，有不可忽视的缺点。

董晓燕、刘护等人在专利(公开号CN105111390A)中公开了一种金属螯合纳米介质及制备方法和应用于强化包涵体蛋白复性与集成纯化的方法，具体步骤如下：在平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子表面接枝聚合物制备高电荷密度的金属螯合纳米介质来强化包涵体蛋白的复性与集成纯化的方法，该方法得到的金属螯合纳米介质的电荷密度达到2520-5680μmol/g，远高于当前同电荷蛋白质复性研究中用到的其他介质的电荷密度。极高的电荷密度增强了介质与同电荷蛋白质分子间的静电排斥作用，从而更有效地抑制蛋白质的聚集；纳米介质极高的比表面积使得同电荷的蛋白质分子在空间上得到更有效的定向排布，因此更有利于同电荷蛋白质的复性，但是，此种方法合成的复合载体只针对同种电荷的酶，普适性较差，应用受到限制。

向开军在专利(公开号CN111777659A)中公开了一种普适的、电场驱动的蛋白质固相复性方法，具体步骤如下：首先，制备紧密接触的两层固相凝胶。第一层(底层或前置层)凝胶为很薄的一层非变性，低浓度聚丙烯酰胺凝胶(或性能类似的其他凝胶)，作为蛋白质复性的场所。第二层(上层或后置层)为含有变性剂尿素和变性蛋白质的固相变性琼脂糖凝胶(或性能类似其他凝胶)。将包涵体蛋白质变性裂解液与含有变性剂尿素的液态琼脂糖凝胶(或其他类似凝胶)混合后，加到非变性薄层固相聚丙烯酰胺凝胶(或其他类似凝胶)之上，在低温(优选但不限于4℃～7℃)下凝固成含有变性蛋白质的尿素变性琼脂糖凝胶(上层或后置层)。然后，将紧密接触的两层凝胶置于直流电场中，通过电泳方式，使变性琼脂糖凝胶中的变性蛋白质迁移，进入到非变性聚丙烯酰胺凝胶中而复性。复性后的蛋白质在电场中继续迁移，穿过非变性聚丙烯酰胺凝胶进入前方透析袋中或电泳槽中而被回收。这种方法能够便利的进行酶的复性，但是需要构建复杂的实验装置和外加条件，使用条件受限。

发明内容