[发明专利]一种呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原、完全抗原和血清抗体的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原、完全抗原和血清抗体的制备方法及其应用，包括以下步骤：将化合物Ⅰ和化合物Ⅱ进行亲核取代反应合成得到中间体Ⅲ；将中间体Ⅲ与化合物Ⅳ进行亲和取代反应并将所得产物进一步水解得到一类具有醛基和羧基及苯偶联芳香基结构的AOZ衍生化半抗原连接手臂Ⅴ；将AOZ与连接手臂Ⅴ通过胺醛缩合反应进行偶联，合成得到一大类具有苯偶联芳香基结构的AOZ衍生化半抗原；将制备得到的人工抗原进行动物免疫。本发明设计的双芳香基结构的新型半抗原连接手臂增加了AOZ衍生物分子量，制备得到的完全抗原更容易被免疫细胞识别，在AOZ半抗原结构上的创新能够使动物机体产生更好的免疫应答效果。

技术领域

本发明涉及免疫化学技术领域，具体是一种呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原、完全人工抗原的制备方法及其应用。

背景技术

呋喃唑酮是一种人工合成的硝基呋喃类抗生素，其原药和代谢物都具有相当大的毒性和致癌致畸致突变作用，已经被禁止使用，但是因为价格便宜，药效好，受经济利益驱使，目前许多国家非法使用现象仍很严重，因此加强对动物性食品中呋喃唑酮及其代谢物的检测监控就显得十分紧迫和必要。呋喃唑酮原药在动物体内不稳定，代谢迅速，无法直接检测，而其代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)却能与动物组织中的蛋白质迅速并稳固结合，因此将 AOZ作为检测动物性食品中呋喃唑酮残留量的靶向检测物。传统的AOZ残留分析方法包括分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等，这些方法虽然可以精确定量，但需要复杂昂贵的仪器和专业技术人员，存在高成本、低通量、操作复杂，检测速度慢等缺点，很难达到快速、简便、高通量的现场检测要求。

免疫分析方法是以抗原与抗体特异性、可逆分子识别理论为基础的分析技术，适用于复杂基质中痕量组分的分析，具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、高通量、低成本、可现场检测等诸多优点，弥补了大型精密仪器分析技术的不足，目前发展迅速，逐渐成为有毒有害残留物快速筛选检测的主要方法之一，在食品安全监测中具有突出优势，也为呋喃唑酮代谢物AOZ的检测提供了新的途径。

AOZ是小分子物质(分子量太小，只有102.09)，免疫原性很低，单独作为抗原很难激发机体的免疫应答反应产生相对应的抗体，必须设法先将 AOZ分子进行衍生化，设计出能够增大AOZ分子结构且易于被机体细胞识别的抗原连接臂，得到的AOZ衍生物与载体蛋白偶联制备出AOZ衍生物人工完全抗原，才能诱导产生抗AOZ衍生物特异性抗体，因此AOZ衍生物抗原的分子设计、合成以及优选将直接影响能否制备出高质量的抗体，是呋喃唑酮代谢物AOZ残留免疫分析的关键所在。国内学者常超等发现AOZ-BSA的抗体对AOZ灵敏度很低，IC₅₀均大于100μg/mL，而通过对醛基苯甲酸作为连接臂与AOZ偶联形成衍生化半抗原CPAOZ后，CPAOZ-BSA免疫产生的抗体对AOZ苯甲醛衍生物(N-苯亚甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮，NPAOZ)灵敏度更高，特异性更好，说明合理的连接臂能够增强抗体亲和力，对建立高效、准确的AOZ残留免疫检测方法具有重要作用。

目前文献报道的AOZ衍生物半抗原连接臂的设计多数为只具有单个苯环的结构，均为同系物，形式较为单一，苯环上连接的碳链较短，得到的半抗原纯度不高，与载体蛋白偶联制备的完全人工抗原免疫小鼠后产生的血清抗体效价不稳定，其特异性和亲和力也不能很好地满足建立高效、准确的AOZ 残留免疫检测方法的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原、完全人工抗原的制备方法及其应用，以解决传统的AOZ衍生物半抗原不足的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原，该半抗原的结构式如下：

其中，R表示

L表示(CH₂)_n或