[发明专利]登革病毒的PCR检测方法

权利要求书

1.一种登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述登革病毒的PCR检测方法包括以下步骤：

1)从待检测样本中提取登革病毒基因组RNA并纯化，获得登革病毒基因组样本；

2)基于登革病毒的四种病毒毒株的5’-UTR共有一致性序列，设计用于逆转录的特异性环状引物，并根据所述特异性环状引物构建特异性逆转录引物，其中，所述登革病毒的四种病毒毒株包括登革病毒1型毒株、登革病毒2型毒株、登革病毒3型毒株和登革病毒4型毒株；

3)利用所述特异性逆转录环状引物对所述登革病毒基因组样本进行逆转录，获得登革病毒的cDNA；

4)对所述登革病毒的cDNA再进行荧光定量PCR检测，以得出登革病毒的Ct值，并根据所述Ct值判断待检测样品是否感染登革病毒。

2.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述待检测样本包括血液、细胞和组织标本中的至少一种；

从待检测样本中提取登革病毒基因组RNA的步骤包括：直接利用Trizol试剂匀浆破碎待检测样本，提取全部RNA分子。

3.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述登革病毒的四种病毒毒株的5’-UTR共有一致性序列如SEQ ID NO：1所示。

4.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述特异性环状引物的序列如SEQ ID NO：2所示。

5.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述特异性逆转录环状引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

6.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，利用所述特异性逆转录环状引物对所述登革病毒基因组样本进行逆转录，获得登革病毒的cDNA的步骤中：所述特异性逆转录环状引物在逆转录酶的作用下，通过特异性碱基与登革病毒5’UTR一致性序列互补配对，获得逆转录产物cDNA。

7.如权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，利用所述特异性逆转录环状引物对所述登革病毒基因组样本进行逆转录，获得登革病毒的cDNA的步骤包括：

1)根据iScriptTM cDNA Synthesis kit将RNA逆转录成cDNA，所有操作均在4℃冰浴上进行，取RNA样品1μg，5′-UTR RT L primer 1μl加适量DEPC水形成总体积为12μl的混合物；

2)将所述混合物置于PCR仪上，65℃反应5min，置于冰上2-3min；

3)向上述混合物中分别加入10mM dNTP Mix 2μl，RiboLock RNase Inhibitor1μl，5×Reaction Buffer 4μl，RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase 1μl，总体系20μL，充分混匀；

4)上述反应体系置于PCR仪上反应42℃，60min，然后70℃温育5min，即获得包含登革病毒四种毒株的特征性cDNA片段。

8.根据权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，对所述登革病毒的cDNA进行定量检测，以得出登革病毒的浓度值的步骤中，所述定量检测通过荧光定量PCR检测方法进行，所述荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：

1)确定正反向特异PCR引物序列，其中

所述正向引物的序列如SEQ ID NO：4所示；

所述反向引物的序列如SEQ ID NO：5所示；

2)确定荧光定量PCR反应体系及反应循环程序；

3)以18S为内参基因，利用所述反应体系和反应循环程序，进行荧光定量PCR的测定及结果判定。