[发明专利]用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法、引物探针组合、试剂盒及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法、引物探针组合、试剂盒及应用。该引物和探针以猪伪狂犬病毒的gC基因进行设计，具有良好的特异性，能够有效判定猪伪狂犬病毒变异毒株。该检测方法采用的PCR反应体系中含有纳米金颗粒，可将最低检出限提高至1000copies/μL，从而具有更高的灵敏度。该检测方法的PCR反应采用的反应程序为三步法，可以有效将扩增效率达到90％～110％。该检测方法特异性好、敏感性高，能够对猪伪狂犬病毒变异毒株进行定性和定量检测，使其具有良好的检测效果，便于在实际生产中进行推广和应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法、引物探针组合、试剂盒及应用。

背景技术

目前，对于猪伪狂犬病毒的检测方法中，较为常用的是采用PCR方法鉴别猪伪狂犬病毒的野毒毒株和疫苗毒株。

猪伪狂犬病毒的野毒毒株又进一步分为经典毒株(PRV-Cla)和变异毒株(PRV-Var)。在现有的检测方法中，选择靶基因时，由于大多数参考文献都认为gE基因能够区分经典/变异毒株，但进行序列比对后，发现变异毒株与经典毒株相比并无较为一致的位点变异规律，对该位点设计探针，也无法对这两种毒株进行鉴别和区分，只能通过基因测序鉴别区分猪伪狂犬病毒经典毒株和变异毒株。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种对猪伪狂犬病毒变异毒株定性检测方法，另一个目的是提供一种对猪伪狂犬病毒变异毒株定量检测方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的引物探针组合，所述引物探针组合为第一组合、第二组合、第三组合或第四组合；

所述第一组合中的引物为如SEQ ID NO.1序列所示的上游引物和如SEQ ID NO.2序列所示的下游引物；探针序列如SEQ ID NO.3序列所示；

所述第二组合中的引物为如SEQ ID NO.4序列所示的上游引物和如SEQ ID NO.5序列所示的下游引物；探针序列如SEQ ID NO.3序列所示；

所述第三组合中的引物为如SEQ ID NO.7序列所示的上游引物和如SEQ ID NO.8序列所示的下游引物；探针序列如SEQ ID NO.6序列所示；

所述第四组合中的引物为如SEQ ID NO.7序列所示的上游引物和如SEQ ID NO.8序列所示的下游引物；探针序列如SEQ ID NO.3序列所示；

优选地，所述引物探针组合为第一组合。

本发明的上述技术方案中，以猪伪狂犬病毒的gC基因设计的上述引物和探针在检测猪伪狂犬病毒变异毒株时具有更高的荧光强度，CT值更低，具有良好的特异性。

进一步，如SEQ ID NO.3序列所示的探针和如SEQ ID NO.6序列所示的探针两端均包含荧光基团和淬灭基团；优选地，所述荧光基团为FAM基团，所述淬灭基团为BHQ1基团；两个探针序列的5’端分别连接所述FAM基团，两个探针序列的3’端分别连接所述BHQ1基团。

本发明提供用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，采用包括上述引物探针组合的PCR反应体系，对含有猪伪狂犬病毒野毒毒株的样本进行扩增和检测。

本发明的上述技术方案中，该方法可实现对猪伪狂犬病毒变异毒株的定性和定量检测。

进一步，采用所述PCR反应体系进行扩增的反应程序为95℃预变性3min；95℃变性10s；55-65℃退火10s；72℃延伸20s，循环数40；优选地，所述退火温度为60℃；优选地，所述延伸的循环数为35-45，更优选地，所述延伸的循环数为40。