[发明专利]用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法、引物探针组合、试剂盒及应用

权利要求书

1.用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合为第一组合、第二组合、第三组合或第四组合；

所述第一组合中的引物为如SEQ ID NO.1序列所示的上游引物和如SEQ ID NO.2序列所示的下游引物；探针序列如SEQ ID NO.3序列所示；

所述第二组合中的引物为如SEQ ID NO.4序列所示的上游引物和如SEQ ID NO.5序列所示的下游引物；探针序列如SEQ ID NO.3序列所示；

所述第三组合中的引物为如SEQ ID NO.7序列所示的上游引物和如SEQ ID NO.8序列所示的下游引物；探针序列如SEQ ID NO.6序列所示；

所述第四组合中的引物为如SEQ ID NO.7序列所示的上游引物和如SEQ ID NO.8序列所示的下游引物；探针序列如SEQ ID NO.3序列所示；

优选地，所述引物探针组合为第一组合。

2.根据权利要求1所述用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的引物探针组合，其特征在于，如SEQ ID NO.3序列所示的探针和如SEQ ID NO.6序列所示的探针两端均包含荧光基团和淬灭基团；优选地，所述荧光基团为FAM基团，所述淬灭基团为BHQ1基团；两个探针序列的5’端分别连接所述FAM基团，两个探针序列的3’端分别连接所述BHQ1基团。

3.用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，其特征在于，采用包括权利要求1或2中所述引物探针组合的PCR反应体系，对含有猪伪狂犬病毒野毒毒株的样本进行扩增和检测。

4.根据权利要求3所述用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，其特征在于，采用所述PCR反应体系进行扩增的反应程序为95℃预变性3min；95℃变性10s；55-65℃退火10s；72℃延伸20s；优选地，所述退火温度为60℃；优选地，所述延伸的循环数为35-45，更优选地，所述延伸的循环数为40。

5.根据权利要求3所述用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，其特征在于，所述PCR反应体系中包含纳米金颗粒；优选地，所述纳米金颗粒在PCR反应体系中体积占比为2％-4％，优选地，所述纳米金颗粒在PCR反应体系中体积占比为4％。

6.根据权利要求3所述用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，其特征在于，所述上游引物或所述下游引物在所述PCR反应体系中的体积百分数为2.4％-8％；优选地，所述上游引物或所述下游引物在所述PCR反应体系中的体积百分数为7.2％；优选地，所述上游引物和所述下游引物的体积比为1:1。

7.根据权利要求3所述用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，其特征在于，所述探针在所述PCR反应体系中的体积百分数为0.8％-2.4％，优选地，所述探针在所述PCR反应体系中的体积百分数为0.8％。

8.根据权利要求3～7任意一项所述用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，其特征在于，所述PCR反应体系中还包含Premix Ex Taq、去离子水以及DNA模板，优选地，所述PremixEx Taq在PCR反应体系中体积占比为50％-60％、DNA模板在PCR反应体系中体积占比为4％-8％、去离子水补足反应体系；更优选地，所述Premix Ex Taq在PCR反应体系中体积占比为50％、DNA模板在PCR反应体系中体积占比为8％、去离子水补足反应体系。

9.一种用于检测猪伪狂犬病毒变异毒株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3～8任意一项所述的方法中采用的所述PCR反应体系；优选地，所述试剂盒中还包含阳性对照溶液；更优选地，所述阳性对照溶液为重组质粒PUC57-PRV-Var标准品溶液。

10.权利要求9中所述的试剂盒在检测猪伪狂犬病毒变异毒株中的应用。