[发明专利]一种用于小麦四种常见病毒的多重PCR检测引物及其应用

说明书

本发明公开了一种用于小麦四种常见病毒的多重PCR检测引物及其应用，属于植物病毒检测技术领域。具体如下，提供了包括四种病毒小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）、小麦梭条花叶病毒（Wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV）、中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）、小麦线条花叶病毒（Wheat streak mosaic virus，WSMV）的多重RT‑PCR检测技术。根据4种病毒的外壳蛋白基因保守序列设计引物，并对多对引物进行筛选，选择退火温度基本一致的引物，并进一步优化RT‑PCR的反应体系及产物扩增条件。最终建立了单个反应体系检测四种不同小麦病毒病害的方法。该技术为田间小麦多种病毒病复合侵染的鉴定与预警打下基础，进一步可以控制病毒病病害危害程度，从而达到增产增收的目的。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体地说，涉及一种用于小麦四种常见病毒的多重PCR检测引物及其应用。

背景技术

小麦（Triticum aestivum L.）是我国重要的战略储备粮食品种，我国是是世界上最大的小麦生产国及消费国，小麦生产对我国粮食安全具有重要意义。小麦在整个生长过程中，常常会遭到多种病毒病的复合侵染，病毒病防治困难，其流行和暴发对小麦生产为害极大。

目前针对小麦病毒病的检测与鉴定有很多种方法，并且其检测与鉴定的方法正朝着方便、高效、快捷、准确的方向不断发展和改进。主要有电镜技术检验方法，分子生物学鉴定方法，血清学检验方法。其中常规的分子生物学鉴定方法具有准确、高效的优点，而相较于其他常规分子检测方法，多重PCR可以检测出侵染小麦的多种病毒，即在同一个PCR反应中加入所有待检病毒的特异性引物，可以同时扩增不同病毒的基因片段，从而同时检测多种病毒。与单一PCR方法相比，该方法可以降低污染风险，节省时间以及降低成本。

小麦黄花叶病毒WYMV与小麦梭条花叶病毒WSSMV是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）成员，均通过土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）进行传播。小麦线条花叶病毒WSMV属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），WSMV是小麦花叶病毒属（Tritimovirus）的典型成员。中国小麦花叶病毒CWMV属于帚状病毒科（Virgaviridae）真菌传杆状病毒属（Furovirus）的成员，其病害也通过禾谷多黏菌（Polymyxagraminis）进行传播。这几种病毒在田间均属于常见病毒，在小麦生长早期为害严重。

发明内容

要解决的问题

针对上述检测技术存在的问题，本发明提供一种小麦四种常见病毒的多重PCR检测引物，同时检测鉴定小麦四种重要病毒病害，快速准确，避免了常规PCR检测的重复操作。该技术灵敏度高稳定性好，在退火52℃-66℃时将cDNA稀释最高到10^-4倍时仍然能检测出多种病毒。

技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种用于小麦四种常见病毒的多重PCR检测引物，所述的多重PCR检测引物包括用于检测小麦黄花叶病毒的引物、用于检测小麦梭条花叶病毒的引物、用于检测中国小麦花叶病毒的引物及用于检测小麦线条花叶病毒的引物；

所述的用于检测小麦黄花叶病毒的引物如下：

其上游引物WYMV-CP-R序列如SEQ ID NO.1所示，

其下游引物WYMV-CP-F序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的用于检测小麦梭条花叶病毒的引物如下：

其上游引物WSSMV-CP-R序列如SEQ ID NO.3所示，

其下游引物WSSMV-CP-F序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的用于检测中国小麦花叶病毒的引物如下：