[发明专利]一种用于小麦四种常见病毒的多重PCR检测引物及其应用

权利要求书

1.一种用于小麦四种常见病毒的多重PCR检测引物，其特征在于：

所述的多重PCR检测引物包括用于检测小麦黄花叶病毒的引物、用于检测小麦梭条花叶病毒的引物、用于检测中国小麦花叶病毒的引物及用于检测小麦线条花叶病毒的引物；

所述的用于检测小麦黄花叶病毒的引物如下：

其上游引物WYMV-CP-R序列如SEQ ID NO.1所示，

其下游引物WYMV-CP-F序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的用于检测小麦梭条花叶病毒的引物如下：

其上游引物WSSMV-CP-R序列如SEQ ID NO.3所示，

其下游引物WSSMV-CP-F序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的用于检测中国小麦花叶病毒的引物如下：

其上游引物CWMV-CP-R序列如SEQ ID NO.5所示，

其下游引物CWMV-CP-F序列如SEQ ID NO.6所示；

用于检测小麦线条花叶病毒的引物如下：

其上游引物WSMV-CP-R序列如SEQ ID NO.7所示，

其下游引物WSMV-CP-F序列如SEQ ID NO.8所示。

2.一种如权利要求1所述的多重PCR检测引物在小麦黄花叶病毒、小麦梭条花叶病毒、中国小麦花叶病毒及小麦线条花叶病毒检测中的应用。

3.根据权利要求2所述的多重PCR检测引物在小麦黄花叶病毒、小麦梭条花叶病毒、中国小麦花叶病毒及小麦线条花叶病毒检测中的应用，其特征在于：

提取待测样品的总RNA作为模板，接着进行cDNA第一链的合成，利用多重PCR检测引物进行RT-PCR反应，取RT-PCR反应扩增产物进行检测。

4.根据权利要求3所述的多重PCR检测引物在小麦黄花叶病毒、小麦梭条花叶病毒、中国小麦花叶病毒及小麦线条花叶病毒检测中的应用，其特征在于：

所述的总RNA的提取方法如下：

（1）液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50-100 mg细粉转入裂解液的离心管，剧烈振荡20s，充分裂解；

（2）12500 rpm，14500×g，离心5-10 min，沉淀不能裂解的碎片；

（3）取上清转到1.5 mL离心管,加入上清0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀；

（4）将混合物加入一个吸附柱中，具体为吸附柱放入收集管中，12000 rpm，13400×g离心2 min，弃掉废液；

（5）加350μL去蛋白液，室温放置1 min，12000 rpm离心30 s，弃掉废液；

（6）向吸附柱中央加入50μL的DNase I，室温放置15 min；

（7）向吸附柱中加入350μL去蛋白液，12,000 rpm，13,400×g离心30 s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

（8）加入500μL漂洗液，12,000 rpm，13,400×g离心30 s，重复一次；

（9）取出吸附柱，放入一个RNase Free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase Free H₂O，室温放置1 min，12,000 rpm，13,400×g离心1 min；

（10）产物可直接用于反转录或-80℃保存。

5.根据权利要求3所述的多重PCR检测引物在小麦黄花叶病毒、小麦梭条花叶病毒、中国小麦花叶病毒及小麦线条花叶病毒检测中的应用，其特征在于：

所述的cDNA第一链的合成的方法如下：

在离心管中加入Total RNA/mRNA≤9μL；gDNA Eraser 1μL；RNaseFree H₂O补齐至10μL，42℃孵育5 min；2×SPARK script II RT Plus 10μL，50℃孵育30 min；85℃反应5 min，产物直接用于RT-PCR或-20℃保存。