[发明专利]一种检测双链DNA错配类型及位置的方法

说明书

本发明属于基因检测技术领域，公开了一种检测双链DNA错配类型及位置的方法，其包括如下步骤：将双链DNA样品以及可与特定类型碱基错配位点选择性结合的配体结合后，通过α‑溶血素纳米孔检测平台检测所述双链DNA样品与所述配体结合前后的热稳定性差异指标，得到所述双链DNA的错配碱基类型与位置信息。本发明在单分子水平上，直接利用加入配体前后双链解旋时间的热稳定性差异来获得关于双链DNA的错配和错配类型及位置的信息，与现有技术相比，具有明显的时间优势。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种检测双链DNA错配类型及位置的方法。

背景技术

基因突变给全球健康和可持续发展带来了巨大威胁。对基因突变的类型和错配的位置的快速诊断一直是生物传感器领域追求的目标。尽管已经有许多文献报道了优秀的DNA检测生物传感器，包括基于PCR扩增、微阵列、荧光和电化学等传感原理的传感器，但单分子分辨率的纳米孔技术在准确性和特异性方面仍显示出非竞争优势，特别是对于蛋白质纳米孔，除了耗时的DNA测序目的外，蛋白质纳米孔也可以开发成体外诊断(IVD)平台。近年来，人们对小分子、miroRNA、DNA、肽、蛋白质等靶点进行了深入研究，揭示了纳米孔技术的强大特性。

当前许多现有文献虽报道了DNA双链中的单碱基错配的检测以及microRNA的单碱基突变、碱基修饰和切除的检测，但截至目前，如果不通过用蛋白质纳米孔进行耗时的DNA测序，仍然难以找到一种简单的方法来同时获得关于错配和错配类型的信息；有最新的研究报道指出，由于α-HL纳米孔前庭中的闭锁区直径略大于双链DNA的横截面，因此可以通过错配碱基对和闭锁区之间的相互作用来区分包括C-A、C-T、T-C等在内的单错配；然而，其所使用的浓度较低的盐环境需要用于更大的电流信号，这会牺牲纳米孔检测的灵敏度。此外，这种方法要求双链不匹配对的位置必须靠近锁存区，这妨碍了灵活的设计和广泛的应用。因而，设计一种简便而不受太多限制的，且可检测双链DNA错配类型和位置的方法是非常需要的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种检测双链DNA错配类型及位置的方法，在单分子水平上，直接利用加入配体前后双链解旋时间的热稳定性差异来获得关于双链DNA的错配和错配类型及位置的信息，以解决上述问题。

本发明的目的采用以下技术方案来实现：

一种检测双链DNA错配类型及位置的方法，具体是将双链DNA样品以及可与特定类型碱基错配位点选择性结合的配体结合后，通过α-溶血素纳米孔检测平台检测所述双链DNA样品与所述配体结合前后的热稳定性差异指标，得到所述双链DNA的错配碱基类型与位置信息。

α-溶血素(α-Hemolysin，αHL)是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的一种分子量为33.2kD的水溶性蛋白质单体，在磷脂双分子层上可组装成分子量为232.4kD的蘑菇型七聚体蛋白质纳米孔，孔道总长约10nm，该纳米孔结构稳定，能够完整的装载在双层脂膜中不漏电，是理想化的纳米孔检测器件。α-溶血素纳米孔有两个敏感区：前庭的闭锁区和β-桶的中央收缩区，以两条单链长尾标记的双链DNA为原型，可以阐明α-HL纳米孔的整体传感机制。在跨膜电压的驱动下，单分子水平的负电荷DNA首先被α-HL纳米孔的前庭捕获，然后单链尾丝通过中心收缩进入β-桶的狭窄通道；由于锁存区和中央收缩区分别是α-HL纳米孔中前庭和β-桶的最窄部分，它们两者对溶液中的局部环境波动都非常敏感，因此，锁存区一般被用来检测双链DNA的细微变化，包括缺口位点、碱基对错配、核苷取代和酶活性；直径小于2nm的中央收缩区由于可以阻止双链DNA的易位行为并迫使双链DNA解旋，其解旋时间高度依赖于用于双链热稳定性，因而可以通过其解旋时间来有效区分错配碱基对、小配体结合、肽等其他靶点。

在本发明的一些实施方式中，所述特定类型碱基错配位点包括G-G、G-T、G-A、C-C、A-A、T-T、C-A、C-T或T-C。在本发明的一些实施方式中，所述特定类型碱基错配位点为G-G时，所述配体为2-氨基-1,8-萘啶二聚体。