[发明专利]一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法

说明书

本发明公开了一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法，其包括如下步骤：用SEPT9片段作为甲基化分析片段，将SEPT9嵌入PUC57中得到PCST9DNA；对PCST9DNA进行甲基化处理，得到甲基化处理后的PCST9DNA；将甲基化处理后的PCST9DNA以及未甲基化的PCST9DNA进行双内切酶消化，经过甲基化处理的PCST9DNA无法被HhaI和BstUI内切酶识别而保持完整的DNA双链，未甲基化的PCST9DNA则被HhaI和BstUI内切酶识别并完全消化；对甲基化处理后的PCST9DNA通过聚合酶链反应扩增出双链DNA产物；用玻璃管纳米孔传感器对双链DNA产物进行分析。

技术领域

本发明涉及DNA甲基化领域，具体涉及一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法。

背景技术

DNA甲基化是通过不改变基因序列而引起遗传变化的最重要的表观遗传修饰之一1。通常DNA甲基化的发生比较常见的是在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸CPG岛中胞嘧啶5位碳原子上，而异常的DNA甲基化也是早期癌症发生的标志2。故DNA甲基化分析已成为癌症诊断和治疗监测中最有前景的生物标志之一3，DNA甲基化分析也得到了越来越多的研究，其中应用较广泛的DNA甲基化分析方法包括亚硫酸盐处理法4和甲基化敏感限制性内切酶分析法5。亚硫酸氢钠处理法是DNA甲基化分析方法中被认为是DNA甲基化分析的金标准，它依赖于亚硫酸氢钠将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变6。该法可以区分甲基化胞嘧啶和胞嘧啶，也有较高的灵敏度，但它在亚硫酸氢钠转换时可能会导致DNA降解从而使得DNA浓度降低7。在此方法的基础上，通过如滚环扩增8(RCA)、超支化滚环扩增9(HRCA)、表面等离子体共振10和基于阳离子共轭聚合物的荧光共振能量转移DNA甲基化分析方法11等新方法发展起来，但这些方法需要DNA聚合酶介导扩增且其过程复杂，一定程度上限制了它们在临床试验的广泛应用12。甲基化敏感的限制性内切酶法通常包含未甲基化DNA的裂解和后续甲基化DNA的检测，当某DNA序列被甲基化后，那么该序列将因内切酶无法识别和切割从而保留完整的原序列，而未甲基化的DNA序列则被内切酶识别而消化掉从而发生裂解，而后续DNA甲基化状态可以由电泳表征或定量分析确定，同时该法的条件温和，操作简单迅速13。通过此法与聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)或重组酶聚合酶扩增(RPA)等扩增手法结合14，可以更容易分析DNA甲基化，然而如果未甲基化DNA消化不完全会导致出现假阳性的结果，从而无法达到低丰度的DNA甲基化分析检测15。而有研究表明16，双甲基化敏感的限制性内切酶系统比单酶内切酶具有更强的消化能力，这很大程度上能解决未甲基化DNA消化不完全而导致出现假阳性的结果，但扩增的结果还是会存在少量的假阳性。另外研究员们尝试不以扩增手段，如引入纳米颗粒作为DNA探针或基底辅助物等进行电化学发光17或荧光检测18，这些方法虽然不会引起假阳性，也一定程度上可以降低DNA甲基化的检测下限，但大多数研究分析DNA甲基化的检测下限基本在fM级别以上。近年来，还有一些使用无标记并快速的方法(如电传感器19、表面增强拉曼光谱20和密度泛函理论(DFT)21)进行DNA甲基化分析，但这些方法只能分析检测浓度为pM级别以上的较高丰度的甲基化DNA。因此若要分析更低丰度的DNA甲基化，那么其检测下限是一个重要的挑战。