[发明专利]一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法在审
| 申请号： | 202210948410.3 | 申请日： | 2022-08-09 |
| 公开（公告）号： | CN115305278A | 公开（公告）日： | 2022-11-08 |
| 发明（设计）人： | 王家海;陈兰芳 | 申请（专利权）人： | 广州大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12Q1/686;C12Q1/6886 |
| 代理公司： | 广州高炬知识产权代理有限公司 44376 | 代理人： | 孔令环 |
| 地址： | 510006 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 限制性 内切酶 纳米 检测 结合 dna 甲基化 方法 | ||
1.一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：用SEPT9片段作为甲基化分析片段，并将SEPT9嵌入PUC57中，得到PCST9DNA；
第二步：对PCST9DNA进行甲基化处理，得到甲基化处理后的PCST9DNA；
第三步：将甲基化处理后的PCST9DNA以及未甲基化的PCST9DNA进行双内切酶消化，经过甲基化处理的PCST9DNA无法被HhaI和BstUI内切酶识别而保持完整的DNA双链，未甲基化的PCST9DNA则被HhaI和BstUI内切酶识别并完全消化；
第四步：对甲基化处理后的PCST9DNA通过聚合酶链反应扩增出双链DNA产物；
第五步：用玻璃管纳米孔传感器对双链DNA产物进行分析。
2.根据权利要求1所述的限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法，其特征在于：所述第三步中的双内切酶消化包括以下内容：将足够数量的甲基化与未甲基化PCST9DNA各自加入到20μL包含1×rCutSmartbuffer，10UofBstUIand20UofHhaI，然后在37℃和60℃各孵育1小时。
3.根据权利要求2所述的限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法，其特征在于：所述rCutSmartbuffer包括50mM醋酸钾、20mM氨基甲烷醋酸盐、10mM醋酸镁以及100μg·mL-1重组白蛋白，PH为7.9。
4.根据权利要求1所述的限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法，其特征在于：所述聚合酶链反应包括以下类容：5μL正向引物和反向引物与2×PCRMasterMix混合后，加入5μL甲基化处理后的PCST9DNA，最后添加10μL无酶水至总反应体系为50μL。
5.根据权利要求4所述的限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法，其特征在于：所述2×PCRMasterMix包括25μL扩增酶，反向引物为5μM。
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