[发明专利]一种用于全细胞催化制备β-烟酰胺单核苷酸的重组菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于全细胞催化制备β‑烟酰胺单核苷酸的重组菌及其构建方法和应用；采用该方法将核糖‑1‑激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、烟酰胺核糖激酶及聚磷酸激酶通过表达载体pBADhisB导入到大肠杆菌突变株K12△aphA△nadR△rihC中构建的重组菌KN‑01，通过弱化NMN的消耗途径和烟酰胺核糖的降解途径，以及NMN的合成逆反应，有效地提高了NMN的产量和底物NR的转化效率，KN01菌株组NMN的产量最高，烟酰胺核糖的转化率最高，明显高于K12菌株及KN02/03/04/05/06/07工程菌组；以浓度为0.2M的核糖/烟酰胺为底物，KN01菌株的转化率均在95％以上，产量均大于65g/L，底物残留量低，便于下游结晶精制；采用本发明的方法构建的基因工程菌生产NMN，具有原料低廉，工艺简单，生产效率高等优点，具有良好的工业化应用前景。

技术领域

本发明具体涉及一种用于全细胞催化制备β-烟酰胺单核苷酸的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononuclotide，简称NMN)天然存在于生物体内，是哺乳动物体内辅酶I烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadeninedinucleotide，NAD⁺)合成途径的关键前体。NAD⁺参与了机体许多重要的生理过程，其异常代谢严重影响机体细胞和组织的健康，随着年龄增长NAD⁺在体内的含量逐渐降低。NAD⁺分子量大，无法直接通过口服转运至胞内，而是需要通过摄取前体，在胞内少量合成。近年来《Science》、《Nature》和《Cell》等国际权威学术期刊陆续发表相关研究报道，补充NMN能增加和恢复体内NAD⁺水平，有效延缓衰老和防止老年痴呆症等多种神经元退化疾病。因此，因而，NMN在食品保健、医药及日化行业中具有巨大的开发潜力和广阔的市场前景。美国FDA、日本MHLW和欧盟ESFA等国家先后批准NMN作为膳食补充剂进行市场销售，我国药监局也于2022年1月24日进行NMN化妆品新原料备案公示。

目前，NMN的生产方法有化学合成和酶法转化两种方式。化学合成以呋喃糖或烟酰胺核糖为原料经过缩合及磷酸化合成NMN，反应条件苛刻，杂质多、收率低、成本高，且涉及大量有毒有害试剂的使用，限制了其在食品领域中的应用。因此，酶法转化成为NMN的主流生产方式，其中，半酶法以烟酰胺核糖(NR)或其氯化物(NRCl)为底物，经烟酰胺核糖激酶(NRK)一步转化获得NMN，工艺稳定成熟，转化率高。例如，CN 114107160 A公开了以NRCl和三磷酸腺苷(ATP)为底物，以六偏磷酸钠为ATP再生体，在烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸激酶的催化下生成NMN；全酶法以烟酰胺和核糖为底物，经烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和核糖激酶等酶的级联催化获得NMN。公开号为CN110195089A和CN114317515A的中国专利公开了以烟酰胺、ATP和核糖为原料，分别在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶或通过固定化的含有多磷酸激酶(PPK2)、核酮糖-5-磷酸异构酶(RKI1)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prps)以及烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的全细胞催化作用下制备NMN；在上述酶法合成NMN公开的方案中，半酶法的NR原料为化学合成，存在二氯甲烷、甲苯等致癌溶剂残留的风险；全酶法合成虽然原料成本低廉，但是转化率低、纯化工艺繁杂。因而，开发一种成本低、安全高的NMN全酶法合成方法很有必要；公开号为CN112877386A的中国专利“一种一锅法将D-核糖和烟酰胺合成NMN的方法”，其中具体公开了利用磷酸激酶和磷酸核糖异构酶级联催化将D-核糖转化为核糖-1-磷酸，再通过烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶转化制备烟酰胺核糖。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于全细胞催化制备β-烟酰胺单核苷酸的重组菌及其构建方法，并将其应用在NMN的生产中，本发明的重组菌能够直接以D-核糖和烟酰胺、AMP为原料合成β-烟酰胺单核苷酸，够实现β-烟酰胺单核苷酸的高产量、高转化率、低成本且生产工艺简单，为后续工业化生产β-烟酰胺单核苷酸奠定基础。

本发明的技术方案如下：