[发明专利]多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的筛选系统及其应用

说明书

本发明涉及多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的筛选系统及其应用，属于生物技术领域，本发明首先构建含有多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因敲除盒与lacZ基因的重组表达载体，将所述重组表达载体导进改造目的菌株C48‑1株，分别通过利用温度敏感系统与蓝白斑筛选，方便高效地筛选出突变株。该方法实现了多杀性巴氏杆菌基因的成功敲除，并能够大幅度地减少了筛选突变株的时间和精力，达到高效快速地筛选突变株。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种外源基因导入多杀性巴氏杆菌快速筛选系统及其构建方法和应用。

背景技术

禽多杀性巴氏杆菌为卵圆或短杆状的革兰氏阴性菌，其所引起的败血性传染病，以发热、腹泻、呼吸困难为特征，最急性病例迅速死亡，禽感染后表现为急性败血过程，因而又被称为禽霍乱。禽霍乱是一种接触性传染病，危害多种家禽、野禽。其特征表现为急性败血过程，发病率和死亡率都很高。低毒感染或急性发病之后，可出现慢性的、局部性的疾病。这是一种尚无很好防治方法而又造成重大经济损失的禽类疾病，在临床上，常用抗生素和疫苗来预防和治疗多杀性巴氏杆菌引起的疾病。然而，在国家禁抗政策下，目前市面上用于预防该病的疫苗仍然以传统的弱毒活疫苗和灭活疫苗为主，但禽多杀性巴氏杆菌抗原结构较为复杂，且易发生变异，导致目前商品化弱毒疫苗的免疫效果并不是特别理想。弱毒活苗还存在免疫期较短、免疫保护力偏低、局部及全身的反应偏大，可能存在散毒危险、残余毒力引起蛋鸡产蛋率下降等问题，而禽霍乱灭活疫苗的保护效果尚不及弱毒活疫苗，应用较少。在禁抗及兽用细菌疫苗存在不同血清型间交叉保护性差两大难关下，开发有效的巴氏杆菌疫苗有重要的现实意义。

关于防控禽多杀性巴氏杆菌病的基因工程疫苗，目前有多种经典遗传操作系统可选择用于构建禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株，如抗生素自杀系统，SacB选择系统，温敏自杀系统，galk选择系统，NgAgo/gDNA系统，CRISPR cas9基因编辑系统，但均敲除效率低或无法敲除。多杀性巴氏杆菌缺乏高效、简便的遗传操作工具是开发基因工程疫苗的重大难题。

发明内容

针对现有技术中多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株敲除效率低、筛选低效等问题，本发明将温敏自杀系统与X-Gal蓝白斑筛选系统相结合，建立了高效的巴氏杆菌基因编辑方法，成功构建出了多杀性巴氏杆菌glgB和opa基因插入突变株，同时对重组菌株筛选方法进行改进与优化，能高效快速地筛选突变株。

本发明的第一方面，是提供一种用于构建多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的重组表达载体，所述重组表达载体是将lacZ基因和多杀性巴氏杆菌基因敲除盒整合到温度敏感载体中构建所得；所述多杀性巴氏杆菌基因敲除盒是将与目标基因同源的片段的上下臂与庆大抗性基因连接构成。

优选地，所述目标基因为glgB或opa基因。

更优选地，所述重组表达载体采用以下步骤制备：

步骤一、构建温度敏感载体pJJF01：合成温敏复制子Ts-ori，以pET28载体为模板扩增出卡那霉素抗性基因kan及大肠杆菌ColE1复制子，利用无缝连接的方法进行连接转化及筛选，获得温度敏感载体pJJF01；

步骤二、将步骤一所得温度敏感载体pJJF01线性化，扩增lacZ基因，然后将lacZ基因与线性化的温度敏感载体pJJF01连接，经转化、验证正确后，获得具有lacZ基因的温度敏感质粒pFSX001；

步骤三、扩增庆大霉素基因抗性片段；以多杀性巴氏杆菌基因组为模板，分别扩增包含目标基因上游区域和下游区域的DNA片段；将三个DNA片段通过重叠PCR进行连接，获得多杀性巴氏杆菌基因敲除盒；

步骤四、将步骤二所得具有lacZ基因的温度敏感质粒pFSX001线性化，然后与步骤三所得多杀性巴氏杆菌基因敲除盒DNA片段进行无缝连接，经验证正确后，获得用于构建多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的重组表达载体。