[发明专利]多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的筛选系统及其应用

权利要求书

1.一种用于构建多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将lacZ基因和多杀性巴氏杆菌基因敲除盒整合到温度敏感载体中构建所得；所述多杀性巴氏杆菌基因敲除盒是将与目标基因同源的片段的上下臂与庆大抗性基因连接构成；所述目标基因为glgB或opa基因；

所述重组表达载体采用以下步骤制备：

步骤一、构建温度敏感载体pJJF01：合成温敏复制子Ts-ori，以pET28载体为模板扩增卡那霉素抗性基因kan及大肠杆菌ColE1复制子，利用无缝连接的方法进行连接转化及筛选，获得温度敏感载体pJJF01；

步骤二、将步骤一所得温度敏感载体pJJF01线性化，扩增lacZ基因，然后将lacZ基因与线性化的温度敏感载体pJJF01连接，经转化、验证正确后，获得具有lacZ基因的温度敏感质粒pFSX001；

步骤三、扩增庆大霉素基因抗性片段；以多杀性巴氏杆菌基因组为模板，分别扩增包含目标基因上游区域和下游区域的DNA片段；将三个DNA片段通过重叠PCR进行连接，获得多杀性巴氏杆菌基因敲除盒；

步骤四、将步骤二所得具有lacZ基因的温度敏感质粒pFSX001线性化，然后与步骤三所得多杀性巴氏杆菌基因敲除盒DNA片段进行无缝连接，经验证正确后，获得用于构建多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的重组表达载体。

2.一种转化体，其特征在于：所述转化体是将权利要求1所述的重组表达载体转化宿主细胞所得。

3.根据权利要求2所述的转化体，其特征在于：所述宿主细胞为多杀性巴氏杆菌。

4.一种用于构建多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的重组表达载体。

5.一种多杀性巴氏杆菌基因缺失突变体的筛选系统，其特征在于：所述筛选系统是将温敏自杀系统与X-Gal蓝白斑筛选系统相结合；所述筛选系统包括以下步骤：

步骤一、构建权利要求1所述的重组表达载体；

步骤二、将步骤一所述重组表达载体通过电击穿孔法导入多杀性巴氏杆菌，经筛选鉴定，获得阳性克隆子；

步骤三、利用温度敏感系统筛选发生第一次同源重组的单交换菌株：将步骤二所得阳性克隆子转接到含有卡那抗生素抗性的TSB培养基中，42℃高温摇菌16h以上后取菌液涂到含有卡那抗生素抗性的TSA平板上；通过鉴定、筛选所述重组表达载体与多杀性巴氏杆菌基因组发生第一次同源重组的单交换菌株；

步骤四、利用蓝白斑筛选原理筛选发生第二次同源重组的双交换菌株：将步骤三所得单交换菌株转接到无抗TSA平板上，置于30度培养箱连续传三代，再将第三代单交换菌株涂到同时含有庆大抗生素和X-Gal的TSA平板上，24小时后从平板上挑选出白色单菌落进行pcr鉴定，筛选发生第二次同源重组的双交换菌株，即突变株。

6.权利要求1所述的重组表达载体、权利要求2所述的转化体、权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的筛选系统在多杀性巴氏杆菌基因敲除突变和突变株筛选中的应用。