[发明专利]一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法

说明书

一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。本发明通过从番茄中得到SlDCD2基因完整的编码序列，设计靶点，将靶点连接到载体CRIPSR‑Cas9上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得基因编辑植株，对基因编辑植株进行了分析，结果表明该基因编辑后能够加速番茄果实成熟。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法，特别涉及一种编码番茄D-半胱氨酸脱巯基酶的基因SlDCD2，该基因在促进番茄果实成熟中的应用。

背景技术

番茄（学名：Solanum lycopersicum），即西红柿，是管状花目、茄科、番茄属的一种一年生或多年生草本植物。番茄原产南美洲，中国南北方广泛栽培。番茄的果实营养丰富，具特殊风味。硫化氢（H₂S）是继NO和CO之后的第三种内源性气体信号分子。在植物体中，H₂S参与调控气孔关闭、种子萌发、根系发育、光合作用、生物和非生物胁迫等生理过程。D-半胱氨酸脱巯基酶DCD2分解D-半胱氨酸，产生H₂S，它在番茄里的作用机制目前尚不清楚。

番茄果实类胡萝卜素的合成、叶绿素的降解、细胞壁降解、乙烯的合成与传导过程与果实成熟密切相关。番茄作为典型的呼吸跃变型果实，在果实成熟阶段，果实的颜色、质地、风味和口感等感官属性都发生显著的变化。目前，已经发现有多个基因控制果实的成熟，例如在S-腺苷-Met合成酶1基因（SlSAMS1）被激活表达后，S-腺苷-Met积累，乙烯产量升高，果实成熟加速；细胞壁水解酶β-半乳糖苷酶基因DkGAL1的表达量在果实成熟期间增加了25.01倍，且将该基因在番茄中过表达后果实硬度下降了23.83%；叶绿体金属蛋白酶L2敲除后叶绿体发育受阻，前期果实呈现白色，且类胡萝卜素和番茄红素的积累缓慢。寻找新的参与调控果实成熟的功能基因，依然是园艺领域的重要目标，有助于提高农作物的商业价值。

虽然番茄的栽培面积不断扩增，但在许多地区番茄的消费过程还是受到运输、贮藏、出售等因素的限制。8-9月为番茄成熟的高峰期，在此期间番茄供过于求，出售缓慢，导致很多番茄发霉、腐烂，影响番茄的质量，这不仅造成资源浪费，还给广大生产者带来经济上的损失，而选育早熟的番茄品种可以减少上述损失。早熟番茄的生长周期短，着色进程快，果实成熟提前，可以提早上市，这不仅可以提高番茄的商品性，还可以提高种植户的经济效益，调节淡季市场供应。

CRISPR/Cas系统由两部分构成：成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白(Cas)。该系统发挥作用需要sgRNA(small guide RNA)和基因序列上的PAM结构(5′-NGG)指引Cas蛋白发挥核酸内切酶作用。目前已知的Cas蛋白种类繁多，目前应用最广的Cas9属于Ⅱ型系统:Cas9与sgRNA结合形成复合体，构象发生改变，在sgRNA的引导下，该复合体能够识别基因序列上的PAM位点并锚定到靶位点。在Cas蛋白核酸内切酶的作用下，靶位点产生精确的双链断裂，启动细胞的自我修复机制。在通过非同源末端连接或同源重组途径进行修饰的过程中，对靶基因进行遗传修饰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的基因，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的调控方法，包括下列步骤：

步骤1：将靶点一正向引物-F₁、靶点一反向引物-R₁、靶点二正向引物-F₂和靶点二反向引物-R₂用无菌ddH₂O混合稀释至浓度为1 μM，然后置于PCR仪中，88-92℃条件下处理25-35 s，然后移至室温冷却，完成靶点引物退火，得到靶点接头引物混合物；