[发明专利]一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法在审

专利信息
申请号: 202210850834.6 申请日: 2022-07-20
公开(公告)号: CN115558671A 公开(公告)日: 2023-01-03
发明(设计)人: 张华;胡康棣;姚改芳 申请(专利权)人: 合肥工业大学
主分类号: C12N15/60 分类号: C12N15/60;C12N15/113;C12N15/84;A01H5/08;A01H6/82
代理公司: 苏州翔远专利代理事务所(普通合伙) 32251 代理人: 王华
地址: 230000 *** 国省代码: 安徽;34
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摘要:
搜索关键词: 一种 促进 番茄 果实 成熟 基因 及其 调控 方法
【权利要求书】:

1.一种促进番茄果实成熟的基因,其特征在于:所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。

2.一种促进番茄果实成熟的调控方法,其特征在于:包括下列步骤:

步骤1:将靶点一正向引物-F1、靶点一反向引物-R1、靶点二正向引物-F2和靶点二反向引物-R2用无菌ddH2O混合稀释至浓度为1 μM,然后置于PCR仪中,88-92℃条件下处理25-35s,然后移至室温冷却,完成靶点引物退火,得到靶点接头引物混合物;

靶点一正向引物-F1:5’-GTCACAATGGCAGCAGCCAAGAAA-3’;

靶点一反向引物-R1:5’-AAACTTTCTTGGCTGCTGCCATTG-3’;

靶点二正向引物-F2:5’-GTCAGGATGCACTACTCCCTCTCT-3’;

靶点二反向引物-R2:5’-AAACAGAGAGGGAGTAGTGCATCC-3’;

步骤2:配制包含步骤1中靶点接头引物混合物的酶切连接反应液,利用边切边连法,使靶点接头与gRNA表达盒连接,扩增gRNA表达盒;

步骤3:以步骤2得到的产物为模板,进行第一轮PCR扩增;

步骤4:以步骤3得到的第一轮PCR扩增产物为模板,进行第二轮PCR扩增,扩增完成后估测产物浓度;

步骤5:把步骤4得到的2个二轮PCR产物等量混合,用DNA产物纯化试剂盒纯化后取2 μL纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳,检查产物纯化效果,浓度不低于5ng/μL即可进行下一步;

步骤6:利用边切边连法进行gRNA表达盒与Cas9质粒的连接;

步骤7:连接完成后取步骤6连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,测序检测;

步骤8:将Crispr/Cas9-SlDCD2质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞;

步骤9:将含有Crispr/Cas9-SlDCD2质粒的EHA105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗dcd2

3.根据权利要求2所述的促进番茄果实成熟的调控方法,其特征在于:步骤2中,酶切连接反应液为:1μL的10×cutsmart buffer,20ng的pYLgRNA-AtU#质粒,0.5μL的靶点接头引物混合物,0.4 μL的BsaI,0.1μL的T4 DNA ligase,0.4μL的T4 DNA ligase buffer,ddH2O补足至10 μL;PCR扩增参数为:37℃,5min;20℃,5min;5个循环。

4.根据权利要求2所述的促进番茄果实成熟的调控方法,其特征在于:步骤3包括2个PCR扩增反应,第一个第一轮PCR扩增为50 μL反应体系:1 μL的边切边连产物,4μL的引物对U-F/Rn,1μL的dNTPs,1 μL的Super-Fidelity DNA Polymerase,10 μL的5×Super-Fidelity DNA Polymerase buffer,33 μL的ddH2O;PCR条件:95℃,1 min;95℃,10s;60℃,15s;72℃,15s;25个循环;72℃,10 min;4℃,∞;第二个第一轮PCR扩增为50 μL反应体系:1μL的边切边连产物,4 μL的引物对Fn/gRNA-R,1 μL的dNTPs,1 μL的Super-Fidelity DNAPolymerase,10μL的5×Super-Fidelity DNA Polymerase buffer,33μL的ddH2O;PCR条件:95℃,1 min;95℃,10s;60℃,15s;72℃,15s;25个循环;72℃,10 min;4℃,∞;

U-F:5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’;

gRNA-R:5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’。

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