[发明专利]多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的方法

说明书

本发明属于分子检测技术领域，具体公开一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的方法，以及检测中使用的引物、探针等，引物包括用于分别扩增Arah1‑1、Arah1‑2、Arah1‑3或Arah1‑4基因片段的引物，所述Arah1‑1基因片段的引物包括SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列；所述Arah1‑2基因片段的引物包括SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列；所述Arah1‑3基因片段的引物包括SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列；所述Arah1‑4基因片段的引物包括SEQ ID NO:10～11所示核苷酸序列，本发明采用四对引物和探针同时对花生主要过敏原Arah1基因进行检测，有效的提高了检测的准确性，抗干扰性强，减少了检测出假阴性的概率。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的方法。

背景技术

花生是重要的经济作物，是“90年代中国食物结构改革与发展纲要”中提出的重点开发利用的植物蛋白之一。它含有维生素B1、B6等天然营养物质，被认为是烟酸、维生素E的良好来源，有着“长生果”的美誉。研究表明，摄入这些营养物质对健康有广泛的益处，例如降低患癌的风险、促进心脏健康、保持认知和思维能力等。对于大多数人来说，花生摄入量的增加可以被认为是一种营养优势；然而，对于花生过敏患者来说，食用含有未标识花生成分的食品将会引起严重的过敏反应。与其他食物的过敏相比，花生过敏所导致的症状极其严重，极低的摄入量就能引发消化系统、呼吸系统以及皮肤的损伤，甚至引起过敏性休克危及生命。目前，针对花生过敏尚缺乏准确的治疗方案，对致敏成分进行准确标识、避免食用致敏食品仍是保障过敏患者食品安全的主要途径。欧盟、美国等发达国家为了保护消费者的权益，强制要求食品包装标签中标识过敏原成分。而我国在2018年也对《食品安全国家标准预包装食品标签通则》的修订草案进行了征求意见，该草案中将致敏物质标示由推荐性条款变为强制性条款。食品在生产加工、储存、运输、销售过程中都有可能被过敏原污染。因此，确定各类加工食品中是否含有花生过敏原成分，对于预防食用者发生花生过敏反应具有重要意义。

目前发现的花生主要过敏原为Arah1-8与一种脂蛋白。Arah1和Arah2被认为具有高度致敏性，超过95％的花生过敏患者血清中都能检测到对抗这两种过敏原的Ig G和IgE，尤其是Arah1蛋白，占花生总蛋白含量的12％-16％。检测食物过敏原的方法分别有蛋白质组学法、免疫学法和基于DNA的检测，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)、质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)等。上述方法各有优缺点，ELISA是常规分析中应用最广泛的技术，其灵敏度高、成本低、速度快，但它在复杂或加工食品基质中展现出了不可忽视的缺点：由于加热过程会改变蛋白质的一级结构，导致抗体无法正确识别被检测的过敏原，产生假阴性现象；此外，采用抗原抗体技术不可避免地会产生交叉反应，导假阳性现象产生。所以ELISA法无法用于花生致敏蛋白的准确定量。MS可以在同一分析中检测多种过敏原，作为一种潜在的验证方法受到广泛关注，但因为标准品缺乏，在无法获得标准品的情况下，利用此法不能建立定量和定性的关系，除此之外，花生蛋白质之间的理化性质较为接近，也使得传统的液相色谱法和毛细管电泳法无法使蛋白质之间达到基线分离，甚至一些极为相似的蛋白质根本无法分离。PCR是一种以检测DNA/RNA为基础的方法，在食品工业加工过程中，花生过敏原的DNA即使经高温长时间处理，也能保持一定的完整性，相比于检测花生过敏原蛋白成分的方法，检测其DNA的残留就显得更加可靠。