[发明专利]多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的方法

权利要求书

1.一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的引物，其特征在于，包括用于分别扩增Arah1-1、Arah1-2、Arah1-3或Arah1-4基因片段的引物，

所述Arah1-1基因片段的引物包括SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列；

所述Arah1-2基因片段的引物包括SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列；

所述Arah1-3基因片段的引物包括SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列；

所述Arah1-4基因片段的引物包括SEQ ID NO:10～11所示核苷酸序列。

2.一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的探针，其特征在于，包括分别靶向Arah1-1、Arah1-2、Arah1-3、Arah1-4基因片段的探针，

所述Arah1-1基因片段的探针包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

所述Arah1-2基因片段的探针包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

所述Arah1-3基因片段的探针包括SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；

所述Arah1-4基因片段的探针包括SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的探针，其特征在于，所述探针含有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团包括FAM或HEX，所述淬灭基团包括MGBNFQ、BHQ1、TAMRA或Eclipse。

4.根据权利要求3所述的一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的探针，其特征在于，

所述Arah1-1基因片段的探针5’末端连接有FAM，3’端连接有MGBNFQ；

和/或所述Arah1-2基因片段的探针5’末端连接有FAM，3’端连接有TAMRA；

和/或所述Arah1-3基因片段的探针5’末端连接有HEX，3’端连接有BHQ1；

和/或所述Arah1-4基因片段的探针5’末端连接有FAM，3’端连接有Eelipse。

5.一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和/或权利要求2-4任一所述的探针。

6.权利要求1所述的引物、权利要求2-4任一所述的探针或权利要求5所述的试剂盒在检测花生蛋白过敏原Arah1基因中的应用。

7.一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA得到样品处理液；

(2)多重液滴数字PCR扩增体系配制：包括微滴式数字PCR反应液和样品处理液，所述微滴式数字PCR反应液包括PerfeCTa MultiPlex qPCRToughMix、Fluorescein sodium salt、权利要求1中所述的引物、权利要求2-4任一所述的探针和无菌水，配置得到多重微滴式数字PCR反应混合液；

(3)液滴生成和PCR扩增；

(4)反应结束后进行液滴荧光信号的读取和分析。

8.根据权利要求7所述的一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述微滴式数字PCR反应液与所述样品处理液体积比为11.5:1，最终整体反应体系中的DNA浓度为10-2-10-3ng/μL。

9.根据权利要求7所述的一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的方法，其特征在于，所述步骤(2)中多重微滴式数字PCR反应混合液包括：5×PerfeCTaMultiPlex qPCR ToughMix 5μL、1μMFluorescein sodium salt 2.5μL、25μM 8种正反向引物各1μL、25μM 4种探针各0.25μL、模板DNA2μL和无菌水6.5μL。

10.根据权利要求7所述的一种多重微滴式数字PCR技术检测花生蛋白过敏原Arah1基因的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应程序，反应参数为：Partition 40℃；95℃10min；95℃30s、60℃30s，共进行45个循环；Release P。