[发明专利]一种重要虫媒病毒性疾病多重荧光定量PCR检测试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种重要虫媒病毒性疾病多重荧光定量PCR检测试剂盒及方法，属于分子生物学和核酸检测技术领域。该方法包括了登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒、黄热病病毒各自的捕获探针组、连接探针组以及qPCR扩增引物、Taqman探针组。本发明基于各病毒基因序列的靶向捕获技术可在不进行核苷酸序列提取的情况下对血清/血浆样本中上述5种病毒进行定性和定量分析。本发明实现了用1对引物、5条荧光探针对微量样本中5种病毒的免核酸提取、免反转录的多重实时定性定量检测，极大地降低了检测成本，为登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒、黄热病病毒的快速高效检测提供了有效的新工具。

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，特别是涉及一种重要虫媒病毒性疾病多重荧光定量PCR检测试剂盒及方法。

背景技术

虫媒传染病(Vector-borne diseases)是指由蚊子、蜱、跳蚤等节肢动物传播的疾病，占全部传染病的17％以上，每年造成约10亿人感染并有超过100万人丧生，这其中虫媒病毒性疾病，如登革热(Dengue fever，DF)、寨卡病毒病(ZIKA)、基孔肯雅热(Chikungunyafever,CHIKF)、日本脑炎(Japanese encephalitis,JE)和黄热病(Yellow fever,YF)等占了绝大多数。

这些疾病通过蚊子叮咬传播，引起发热、头痛等常见临床症状，但不同疾病可有不同临床转归，如登革热可导致出血热和休克、寨卡可引起新生儿小头畸形及格林巴利综合征、基孔肯亚病毒可导致严重关节炎、乙脑病毒可引起脑炎并出现严重后遗症、黄热病病毒则可致黄疸和严重的出血热。一种能同时对上述多种病原体进行定性定量检测的方法也将极大的有利于上述疾病的防治，也是提高检测通量、节约人力物力的必然需求。

现有技术中，上述病原体的检测方法主要包括病毒分离培养，酶联免疫检测及PCR检测。病毒培养分离技术用收集的样本与细胞共培养，通过观察细胞病变或其他方法检测病毒的扩增来确定样本中是否有病毒感染。此方法虽然是曾经的病毒感染检测“金标准”，但只能检测样本中的具有感染能力的病毒颗粒，无法确定病原体种类，后续仍需进行PCR扩增或者测序，并且病毒分离培养操作程序复杂，对实验场地和设备有生物安全等级要求，检测耗时长，不能用于现场检测，更不能用于对大规模样品的常规监测。

酶联免疫检测是基于抗体的酶标检测，直接与间接荧光检测以及胶体金快速检测均利用抗原与抗体之间的特异结合，通过偶联显色基团的抗体实现对病原体的可视化检测。抗体检测不依赖大型设备，而且检测结果可在30分钟以内得到。但抗体检测由于没有信号放大的过程，灵敏度低，而且结果容易出现假阳性及假阴性。由于新抗体的制备周期较长，该方法很难用于新出现病毒的检测，而且对于由抗原变异产生的新的病毒亚型的检测能力也值得怀疑。

PCR检测技术是将病原体的核酸分子通过聚合酶扩增后利用电泳、荧光等方法将产物可视化的过程，从而实现对病原体检测/监测的目的。基于凝胶成像的普通PCR在进行1轮或多轮核酸扩增后，还需电泳及成像检测，耗时长且需额外的凝胶成像设备，不适用于大规模样本的快速检测。荧光定量PCR则是通过对荧光信号的检测及收集直接读取结果，拥有操作简便、速度快、灵敏度高、特异性好等优点。荧光定量PCR又可分为探针法、染料法两种，相较于染料法非特异性的荧光信号，探针法通过添加额外的、特异的荧光探针，在保证灵敏度的前提下获得更高的特异性，多重检测还可同时对多种靶标进行定性定量，已被广泛用于临床诊断。

然而，多重检测的引物、探针设计更复杂，往往无法获得单重检测时的效果，故商业化的试剂多为3重，目前尚未有利用实时荧光定量PCR对登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒恒和黄热病病毒共5种病毒进行五重检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种重要虫媒病毒性疾病多重荧光定量PCR检测试剂盒及方法，所述试剂盒能够同时检测登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒和黄热病病毒。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：