[发明专利]一种重要虫媒病毒性疾病多重荧光定量PCR检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒、黄热病病毒的多重qPCR检测用引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的组成如下：

(1)登革病毒的探针为捕获探针和连接探针，所述捕获探针如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：5所示，所述连接探针如SEQ ID NO：2-4所示；

(2)寨卡病毒的探针为捕获探针和连接探针，所述捕获探针如SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：10所示，所述连接探针如SEQ ID NO：7-9所示；

(3)基孔肯亚病毒的探针为捕获探针和连接探针，所述捕获探针如SEQ ID NO：11、SEQID NO：12和SEQ ID NO：15所示，所述连接探针如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；

(4)乙脑病毒的探针为捕获探针和连接探针，所述捕获探针如SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：20所示，所述连接探针如SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；

(5)黄热病病毒的探针为捕获探针和连接探针，所述捕获探针如SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：33和SEQ ID NO：24所示，所述连接探针如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：32所示；

(6)登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒和黄热病病毒的引物，所述引物为qPCR扩增引物，所述qPCR扩增引物如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示；

(7)登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒和黄热病病毒的探针所组成的Taqman探针组，所述探针为特异荧光探针，所述Taqman探针组如SEQ ID NO：27-31所示。

2.一种登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒和黄热病病毒的多重qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解及杂交缓冲液和连接液。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解及杂交缓冲液由以下成分组成：300mM的Tris、1290mM的NaCl、质量浓度为3％的SDS、30mM的EDTA和质量浓度为30％的硫酸葡聚糖。

5.一种检测登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒、黄热病病毒的多重qPCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)利用如权利要求1所述的捕获探针对待测样品进行捕获，得到待测样品的RNA及与其杂交的连接探针；

(2)以步骤(1)捕获的RNA为模板利用连接反应体系对与其杂交的连接探针DNA进行连接；

(3)用如权利要求1中所述的qPCR扩增引物和所述的Taqman探针组对步骤(2)中连接后的DNA进行PCR扩增；

(4)对扩增曲线进行分析，判断待测样品类型。

6.如权利要求5所述的多重qPCR方法，其特征在于，所述的连接反应体系，按照体积计，由以下成分组成：10μL的连接反应液、1μL的SplintR连接酶和39μL的ddH₂O。

7.如权利要求6所述的多重qPCR方法，其特征在于，所述连接反应液由以下成分组成：250μM的Tris-HCl、37.5mM的MgCl₂、50μM的ATP、5mM的DTT和质量浓度为25％的PEG8000。

8.如权利要求5所述的多重qPCR方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃，300s，1次循环；95℃5s，53℃10s，72℃20s，72℃时采集荧光，40次循环。

9.如权利要求1所述引物和探针或如权利要求5-8任一项所述的多重qPCR方法在制备多重登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、乙脑病毒和/或黄热病病毒的检测产品中的应用。