[发明专利]一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及其应用，所述试剂盒包含特异性crRNA、鸭疫里氏杆菌特异性RPA引物对和探针，所述特异性crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述特异性RPA引物对的上游引物RPA‑F、下游引物RPA‑R和探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：3～5所示；探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。所述试剂盒具有成本低，操作便捷、耗时少、灵敏度高和特异性强等特点，全程在37～40℃环境下进行，可以有效脱离实验室大型仪器的依赖。

技术领域

本发明涉及微生物快速检测技术领域，具体地，涉及一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及其应用。

背景技术

鸭疫里氏杆菌病的临床表现与其他细菌感染如多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌相似。因此，很难通过病理特征来诊断鸭疫里氏杆菌感染。诊断鸭疫里氏杆菌感染的实验室方法主要基于平板培养、聚合酶链式反应、环介导等温扩增、酶联免疫吸附试验、凝胶扩散沉淀试验和玻片凝集试验。上述诊断方法的优点是具有较高的灵敏度、特异性和准确性，但上述诊断方法通常需要较长时间，方法比较繁琐或需要昂贵的仪器设备和高技能的人员。

目前鸭疫里氏杆菌感染的确诊仍然以实验室方法为基础，这限制了对鸭疫里氏杆菌杆菌病的早期诊断，早期发现，早期治疗。实验室方法的复杂性，繁琐性也不利于鸭疫里氏杆菌的大规模筛查。开发一种快速、现场、敏感、特异的定量检测方法，对于我国养鸭业具有重要的战略意义。

CRISPR-Cas技术是近年来发展迅猛的基因编辑技术，成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统原本是存在于原核生物体内的一种适应性免疫机制。目前，经过一系列的改造，CRISPR-Cas技术已在基因组编辑、基因表达调控、基因治疗、病原体检测、靶基因高通量筛选、表观遗传修饰等多个生命科学的研究领域被广泛应用。除了作为基因编辑工具，Ⅱ类Cas蛋白如Cas12a蛋白具有的“附属切割”特性，已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法，在快速检测领域具有重大潜力。

重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种等温扩增新技术，广泛用于病原菌核酸分子诊断。RPA用三种核心酶替代了聚合酶链式反应(PCR)所需的热循环。不同于许多其他等温技术，RPA省去了升高或精确控温阶段，扩增反应在25～42℃的温度范围内均可进行，反应通常在5～15min内完成。RPA技术自一出现就崭露头角，因其具有反应迅速(5～15min)、特异性强(引物)、低温运行(25～42℃)、样本容差(对样本类型的要求特别宽松)、灵敏度高(单拷贝)、适用性广、试剂形态灵活(液态试剂或干粉)和检测形式多样等优势，在核酸检测领域得到了广泛应用。

但是由于RPA扩增产物需要琼脂糖凝胶电泳来分析结果，使得该技术无法实施现场的即时检测。近年来，RPA技术也引入荧光探针法，使得检测结果可视化。但是，荧光探针的设计复杂，且探针的特异性不稳定，假阳性的结果时有发生。这在很大程度上限制了RPA技术在快速诊断方面的应用。

将CRISPR-Cas12a检测系统与RPA技术结合，通过RPA技术常温扩增目的片段，然后进行CRISPR-Cas12a检测反应，最后通过Cas12/13专用核酸检测试纸条进行结果的可视化。此结合的意义在于不需要在RPA扩增阶段引入探针，避免假阳性的产生，同时利用CRISPR-Cas12a检测的特异性保证检测结果的准确性。该检测方法只需要改变CRISPR-Cas12a检测反应中的特异性crRNA序列即可实现多种病原微生物的检测，大大提高了检测的适用性及使用范围。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒。