[发明专利]共固定化酶、其制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种共固定化酶、其制备方法及其应用。该共固定化酶包括：氨基树脂载体以及主酶和辅酶，主酶和辅酶共固定于氨基树脂载体上，其中，主酶共价固定于氨基树脂载体上，辅酶为一种且通过非共价方式固定于氨基树脂载体上；主酶选自如下任意一种酶：转氨酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、酮还原酶、烯还原酶及单加氧酶。将主酶及其辅酶共固定于氨基树脂载体上共固定化，提高酶的活性及循环使用效率。

技术领域

本发明涉及固定化酶领域，具体而言，涉及一种共固定化酶、其制备方法及其应用。

背景技术

微生物细胞或分离的酶或工程酶的应用使得生物催化取得了重大进展，且使得制造方式发生了转变。许多种类的酶如酰基转移酶、酰胺酶、转氨酶、酮还原酶、氧化酶、单加氧酶及水解酶等被用于生产涉及抗生素、除草剂、医药中间体和新时代治疗剂的反应中。

当游离酶用作生物催化剂时，会有很大的酶浪费，因为回收水溶性酶非常困难。而水不溶性固定化酶，在每个循环后，通过非常简单的过滤就可以容易地回收。

现有技术中已经有报道单一酶的固定化方法，但不同的酶所适合的固定化方法是不同的。比如Bolivar等(Biomacromol.2006,7,669-673)研究了来自假单胞菌SP101的FDH的共价固定化，包括共价固定于改性琼脂糖、CNBr活化的琼脂糖、Sepabeads(葡聚糖)及乙醛琼脂糖的各种载体上。其得出的结论是：固定化于溴化物，聚乙烯亚胺，戊二醛等活化的载体上并不会促进酶在热灭活下的任何稳定作用。然而，高度活化的乙二醛琼脂糖的优化的酶被证明是具有很高的热稳定性、pH稳定性并且在具有增强的稳定性情况下具有超过50％的活性。

Kim et al(J.Mol.Catal B:Enzy 97(2013)209–214)报道了使用交联酶聚集体(CLEA)的方法来固定来自Candida boidinii.的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，FDH)，并认为葡聚糖多醛(dextran polyaldehyde)作为交联剂代替戊二醛(glutaraldehyde)对于固定化酶更好，经过10次重复使用后残留活性超过95％。此外，葡聚糖多醛形成的交联酶聚集体(Dex-CLEA)的热稳定性比游离酶的热稳定性提高了3.6倍。

Binay et al(Beilstein J.Org.Chem.2016,12,271–277)报道了高活性的来源于Candida methylica的FDH的固定化酶。FDH共价固定到环氧活化Immobead 150载体上，Immobead 150载体先经过乙二胺(ethylenediamin)修饰，然后依次经过戊二醛活化(FDHIGLU)及醛基官能化(FDHIALD)。当使用醛基官能化的Immobead 150作为载体时，分别获得最高的固定化产率和活性产率，分别为90％和132％。在35℃下，游离FDH，FDHI150，FDHIGLU和FDHIALD的半衰期(t1/2)分别计算为10.6、28.9、22.4和38.5小时。FDHI150，FDHIGLU和FDHIALD在10次重复使用后分别保留了其初始活动的69％，38％和51％。

Jackon等(Process Biochem.Vol.1,9,Sep 2016,1248-1255)报道了采用乙二醛-琼脂糖对LDH的固定化。与其可溶性对应物相比，固定化LDH获得的热稳定因子大1600倍。