[发明专利]一种检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒，属于分子生物学及生物技术领域。引物和探针针对2号外显子上的Codon12突变G12D、Codon13突变G13D、3号外显子上的Codon61突变Q61K及3号外显子上的Codon61突变Q61R，试剂盒包含上述的引物和探针，还包括内参体系、10×dPCR Buffer、dPCR酶、微流控芯片、油相A和油相B。本发明的有益效果在于：本发明所提供的人NRAS基因突变检测试剂盒通过数字PCR平台，将PCR反应置于微流控芯片中，通过将所检测模板更多的均匀分布于微流控芯片中，极大地有效的提高了检测的灵敏度和准确度，检测限可达200copies/mL。

技术领域

本发明涉及一种检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒，属于分子生物学及生物技术领域。

背景技术

RAS基因是一种原癌基因，主要调控细胞生长、增殖和分化。RAS蛋白位于细胞膜内侧，与三磷酸鸟苷(GTP)和二磷酸鸟苷(GDP)有很强的的亲和力，在细胞生长分化信号传递方面有重要作用。当RAS基因发生突变时，RAS蛋白结构随之发生改变，与GDP结合能力减弱，可不通过生长信号调节便与GTP结合自身活化，进而造成细胞不可控的进行增殖，导致癌症的发生。

大量研究表明，RAS基因发生突变后，会导致EGFR下游的信号通路活化异常，从而降低针对EGFR靶向药物的疗效(如西妥昔单抗和帕尼单抗等)。明确RAS基因的突变状态对于指导结直肠患者使用抗EGFR靶向药物具有重要意义。

NRAS基因是RAS原癌基因家族的成员，位于1号染色体短臂上(1p31)，负责编码并制造一种称为NRas的蛋白，NRas蛋白通过参与RAS-RAF-MEK-ERK通路，调控基因转录活动和细胞周期，与细胞增殖密切相关。

黑色素瘤发病率及致死率近几年来逐年提高，占全部肿瘤的3％左右，是皮肤癌症中最致命的类型之一。其中大约25％的黑色素瘤是由于NRAS基因的突变导致的，因此NRAS基因对于黑色素瘤的检测及治疗具有至关重要的作用。

目前对于基因突变的检测方法较多，如Sanger测序法、焦磷酸测序法、高分辨率溶解曲线检测法(HRM)、荧光定量PCR法、数字PCR法等。现阶段较为常用的方法为Sanger测序法和荧光定量PCR法，Sanger测序法为基因突变检测等基因检测分析的金标准，对每一个碱基的读取具有极高的准确率，但同时也存在一些缺点，如灵敏度偏低、耗时较长；荧光定量PCR法也是一种常见的基因检测方法，但灵敏度依然存在一定的限制，由于NRAS基因突变检测较少且突变率偏低，因此需要一种较高灵敏度和准确度的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒，通过简单操作将检测液相导入芯片中直接进行扩增，可同时检测多种NRAS基因突变：Codon12突变型：G12D；Codon13突变型：G13D；Codon61突变型Q61K和Q61R，具有极高的灵敏度，检测限可达200copies/mL。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测人NRAS基因突变的引物和探针，针对2号外显子上的Codon12突变G12D的引物和探针的序列为：

正向引物NF1：5′-TGCTGGTGTGAAATGACTG-3′；

反向引物NR1：5′-CTGGATTAGCTGGATTGTCA-3′；

检测探针NP1：5′荧光基团-AACACCATCTGCTC-3′猝灭基团；

封阻探针NB1：5′-CGCTTTTCCCAACACCACCTGCT-3′phosphorylation；

针对2号外显子上的Codon13突变G13D的引物和探针的序列为：