[发明专利]高表达烟碱嵌合基因、其表达载体及应用

说明书

本发明公开了一种高表达烟碱嵌合基因、其表达载体及应用，旨在解决当前烟草中烟碱生物合成效率低的技术问题。本发明通过加倍烟草PMT1启动子上包含G‑box元件的序列“ATGCACGTTGTAAT”，实现对烟草烟碱生物合成基因PMT的调控，并改造设计了相关的嵌合基因、工程菌，将其应用于烟草转化，能够显著提升烟草烟碱的生物合成量。

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种高表达烟碱嵌合基因、其表达载体及应用。

背景技术

烟碱(Nicotin)，又称尼古丁，化学名称为1-甲基-2-(2-吡啶基)吡咯烷，分子式为C₁₀H₄N₂，是一种天然存在于烟草植物中的生物碱。烟碱能够对人产生一定的生理刺激作用，是使烟草具有商品价值的主要因素之一。

目前，烟碱作为重要的工业原料已在食品、保健、医药和日用化工等多个领域得到应用。如烟草替代品生产需要大量的烟碱：目前对烟草依赖的治疗方法包括药物治疗、心理治疗、针灸和中药治疗等，经美国FDA批准的治疗方案和药物主要有烟碱替代疗法如烟碱贴剂、口胶、鼻喷雾剂和吸入剂等，采用nAChR抑制剂药物治疗，如安非他酮、酒石酸瓦伦尼克林以及美卡拉、去甲替林、可乐定和抗焦虑药等，这些烟碱替代物的生产需要大量提取烟碱作为原料；另外，烟碱还广泛应用于环保农药的开发，如烟碱系列农药属植物杀虫剂，因其具有蒸薰、胃毒、触杀功能及迅速降解无残留等特点广泛用于粮食、油料、蔬菜、水果、牧草等农作物的杀虫剂，是生产绿色食品的理想的高效杀虫剂和生物性农药；烟碱还广泛应用在医药工业上，是研制治疗心血管、皮肤病、蛇毒等疾患药物的特种原料；烟碱还可用来制备柠檬酸烟碱，以应用于高级香烟的品种改良剂组分等。而且随着烟草工业、精细化工、制药、有机合成、国防、农药等的迅猛发展。市场对烟碱的需求量与日俱增，特别是高纯烟碱的需求更大，而当前依赖于烟草的烟碱生物合成的获取方式，难以满足需求。

研究表明，参与植物烟碱生物合成的蛋白包括鸟氨酸脱羧酶(ODC)、喹啉酸合成酶(QS)、天冬氨酸氧化酶AO)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)、腐胺 N-甲基转移酶(PMT)、二胺氧化酶(DAO)；更进一步的研究发现，PMT(腐胺 N-甲基转移酶)是烟碱生物合成中的限速酶，其由三个基因编码(PMT1, PMT2, PMT3)。为此，基于对烟碱生物合成相关控制基因的调节改变，也是调控烟草中烟碱生物合成量值得探索的重要途径。

公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

具有高度保守核心序列CACGTT的G-Box元件通常被认为是植物响应外界环境刺激的调控元件（光控基因的光应答元件）；而发明人通过深入研究发现，一定策略的加倍烟草PMT1启动子上包含G-box（CACGTT）元件的序列“ATGCACGTTGTAAT”，则能够高水平启动下游PMT1基因的表达，进而提升烟碱的生物合成量。

根据本公开的一个方面，提供一种高表达烟碱嵌合基因，含有烟碱NtPMT1启动子和与其可操作连接的、编码目的基因的序列；所述烟碱NtPMT1启动子的核苷酸序列为：

（1）如SEQ ID NO.1所示；或

（2）在如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的基础上，加倍含G-box元件的序列ATGCACGTTGTAAT。

在本公开的一些实施例中，所述加倍的倍数为2-10。

在本公开的一些实施例中，所述烟碱NtPMT1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。